黄丽娟 张丽芬

（江门市妇幼保健院 广东 江门 529000）

乙型肝炎病毒已经属于全球性的公共卫生问题，且据统计世界上有20 亿患者感染过HBV 病毒，且有约350 万人长期感染乙肝病毒，其中有5%～10%的感染者将发展为慢性病毒携带者，多数患者终身或者是多年携带乙肝病毒，后续可发展为慢性活动性肝炎，甚至出现肝硬化以及肝癌疾病，对患者的生命健康以及生活质量影响较大，因此给予该类患者及时且有效的检测有着至关重要的作用[1]。当前临床上诊断乙肝的常用方法为免疫学方法以及肝功能检查法，在免疫学检查中，有血清HBV抗体、抗原、HBV-DNA 多聚酶法等。近些年来HBV-DNA 检测已经成为HBV 感染的直接标志，而目前用于乙肝病毒载量分析的主要方法有两种，即国产普通荧光定量PCR 技术与罗氏内标法荧光定量PCR 技术，但是国产的普通荧光定量PCR 检测结果与罗氏内标法荧光定量PCR 检测结果的差异性并不明确[2]。因此本文就两种检测方法在乙型肝炎病毒患者中的应用效果进行研究，具体如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取我院收集的120 例HBV 患者，收集的时间为2017 年5月—2019 年5 月，对所有的标本使用国产普通荧光定量PCR 技术与罗氏内标法荧光定量PCR 技术进行检测。其中男性血清标本70 例，女性血清标本50 例，患者的年龄18 ～75 岁，平均（46.64±2.58）岁。详细记录患者的年龄、性别、病史等，对两组检测的结果进行对比，了解国产普通荧光定量PCR 技术的检测准确率等；再根据乙肝五项定量检测的结果，将所有的血清标本分为HBeAg（+）组、HBeAg（-）组，再将罗氏内标法荧光定量PCR 技术检测组的检测结果与国产普通荧光定量PCR 技术进行差异性分析。

纳入标准[3]：所有的患者符合中国2010 版“慢性乙型感染防治指南”中对HBV 的诊断标准，且被诊断为慢性乙型病毒性肝炎；所有的标本均在患者空腹时采集，且在2 小时之内进行血清分析，之后便保存于-20℃的低温冰箱中。排除标准：采集的血液标本有溶血等现象的发生。

诊断标准[4]：患者符合以下之一者为HBV 感染，①患者原有乙型肝炎病毒感染史，且有HBsAg 携带史，该次就诊原因为HBV 再次出现，且肝功能体征、症状异常；②患者面色晦暗，有蜘蛛掌、肝掌等慢性肝炎的症状，但是患者否认有肝炎病毒感染史；③患者经过肝脏穿刺获取的组织学标本显示有慢性肝炎，并且能够排除其他原因引发的慢性肝炎疾病；④患者为急性乙型病毒性肝炎感染，且病程已经超过6 个月。

1.2 方法

国产普通荧光定量PCR 技术中，所有患者均在清晨抽取2至3 毫升空腹静脉血，每人取3 份标本，普通离心机（厂家：背景雷博尔有限公司），普通荧光定量PCR 检测试剂盒（厂家：上海复星长征医学科学有限公司）；根据试剂盒的说明将模板进行提取，之后配制反应体系，进行PCR 扩增技术，在94℃预变性5 分钟，在94℃预变性15 秒，在60℃预变性30 秒，共进行40 个循环。

罗氏内标法荧光定量PCR 技术中，所有患者均在清晨抽取4 至6 毫升空腹静脉血，每人取3 份标本，且采用EDTA 抗凝剂，将血浆分离后置于零下20℃环境中，微量高速冷冻离心机（厂家：伤害托莫斯科学仪器有效公司），荧光定量PCR 仪器（厂家：美国应用生物系统有限公司），高敏感病毒载量分析仪（厂家：瑞士罗氏公司），检测试剂盒（厂家：瑞士罗氏诊断产品有限公司）；将分离之后得到的1000μl 血浆，加入专用的离心管中，按照试剂盒的操作要求，设置仪器扩增检测参数，并上机检测。试剂均有正式批文，批检合格并在有效期内使用。

1.3 观察指标

（1）根据HBV-DNA 值进行分组，可分为6 组，102≤DNA＜103，103≤DNA ＜104，104≤DNA ＜105，105≤DNA ＜106，106≤DNA ＜107，107≤DNA ＜1.7×108（IU/ml），从本研究的结果可以看出，在罗氏PCR 技术检查下，有9 例小于20IU/ml（罗氏试剂检测下限），有5 例超过1.7×108IU/ml，剩余106 例在检测范围内。而在国产PCR技术检测中，有35例低于500IU/ml（国产试剂检测下限），剩余80 例处于国产试剂范围内。也可以将其按照HBV-DNA 值分为6 组，即102≤DNA ＜103，103≤DNA＜104，104≤DNA ＜105，105≤DNA ＜106，106≤DNA ＜107，DNA ≥107（IU/ml）。

（2）根据乙肝五项定量的检测结果，对所有的标本进行分组，可以分为HBeAg（+）组和HBeAg（-）组，再对两种检测方法的差异性进行分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件对本研究数据进行统计学分析处理，应用（±s）表示计量资料，应用t检验；应用百分率（%）表示计数资料，组间对比应用χ2检验。应用P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 罗氏内标法荧光定量PCR 技术检测HBV-DNA 定量结果

经分析，罗氏内标法荧光定量PCR 技术检测法中，有106例在实际检测值范围内，其中在103≤DNA ＜104（33.02%）内的例数最多，其次为104≤DNA ＜105（23.58%），见表1。

表1 罗氏内标法荧光定量PCR 技术检测HBV-DNA 定量结果（n=106）

2.2 国产普通荧光定量PCR 技术检测HBV-DNA 定量结果

经分析，国产普通荧光定量PCR 技术检测法中，有80 例在实际检测值范围内，其中在103≤DNA ＜104（30.00%）内的例数最多，其次为104≤DNA ＜105（17.50%），见表2。

表2 国产普通荧光定量PCR 技术检测HBV-DNA 定量结果（n=80）

2.3 对比两种方法在HBeAg 阳性患者和阴性患者的检测结果

经分析，罗氏内标法荧光定量PCR 技术与国产普通荧光定量PCR 技术在HBeAg（+）患者中，检测结果无显著差异（P＞0.05）；罗氏内标法荧光定量PCR 技术与国产普通荧光定量PCR 技术在HBeAg（-）患者中，检测结果具有显著差异（P＜0.05），见表3。

表3 对比两种方法在HBeAg 阳性患者和阴性患者的检测结果[n（%）]

3.讨论

乙型肝炎病毒具有较强的传染性，且作为主要传染源的急、慢性乙型肝炎病毒携带者及其患者，能够通过血液、体液、母婴、破损的消化道以及呼吸道进行传播，尤其是易感人群（即HBsAb阴性者）感染，继而引发急性或者是慢性的肝脏病变，严重威胁着人们的身体健康[5]。我国是一个乙型肝炎病毒个数感染的大国，约有1.2 亿感染的人群，因此对于该疾病的准确诊断有着极其重大的意义。血清HBsAg、HBeAb 等检查被广泛应用于乙型肝炎患者的诊断中，也可以用于判定疾病的预后情况。但是由于HBV 存在变异株，其基因会将编码HBeAg 的能力减弱或者是消失，导致在现有的技术中不能进行检测，故而限制了对乙肝疾病进展的判定[6]。而且，乙型肝炎病毒DNA 载量的检测在评价乙肝治疗指征、治疗效果及预后多方面具有重要的意义。

我国现有的PCR 技术是引进国际上公认的罗氏内标法荧光定量PCR 技术，但是该项技术的费用较为昂贵，不能在我国被广泛使用，因而需要研发一种国产的性价比较高的试剂，且与罗氏检测技术相类似的检测方法[7]。但国产的普通荧光定量PCR技术与罗氏内标法荧光定量PCR 技术在结果上的差异尚不明确，因此本研究对乙肝病人进行了两种检测方法对比，可以看出，虽然国产的试剂具有一定的局限性，且准确度以及灵敏度一般，但是具有良好的稳定性，能够大致反映HBV-DNA 水平。本研究中显示，两种检测方法均在103≤DNA ＜104、104≤DNA ＜105中例数最多，表明两种方法具有较好的一致性。且经研究结果显示：两种检测方法在HBeAg（+）患者中，检测结果不具有差异性（P＞0.05）；两种方法在HBeAg（-）患者中，检测结果具有差异性（P＜0.05），提示在乙肝患者中，HBV-DNA 水平与患者的病情严重程度没有显著的相关性，当乙肝患者中检测出HBeAg（-）时，建议应用罗氏内标法检测，以更准确的判断患者的疾病情况，以免延误了患者的诊治，使病情进展为肝硬化或肝癌。

综上所述，两种检测方法在检测HBeAg（+）患者中相比不具有显著差异，但是在HBeAg（-）患者中差异显著，因此有明显乙肝体征、症状的患者，若经国产PCR 技术检测为阴性，建议采用罗氏检测法进行检测或者复查，可以使患者得到有效且有价值的诊断与治疗。