曾 静， 葛文松， 杨蕊旭， 范建高， 汪保灿

上海交通大学医学院附属新华医院 消化内科， 上海 200092

1 病例资料

患儿女性，13岁，藏族。因“皮肤巩膜黄染13年”于2018年12月13日入住本院。患者出生后即出现皮肤巩膜黄染至今，黄染偶可于进食油腻食物后加深，近期劳累后黄染加重，入院前查肝功能：总胆红素343 μmol/L，ALT 17 U/L，AST 37 U/L。病史特点：自幼皮肤巩膜黄染，劳累、进食油腻食物后黄染程度加重，无皮肤瘙痒，无乏力，无关节疼痛。多次查肝功能提示总胆红素升高，波动于200～300 μmol/L，以非结合胆红素升高为主，酶学正常。父母非近亲结婚，患者兄弟姐妹5人，家族中母亲有类似黄疸病史，妹妹出生时有黄疸，但均未行特殊检查。体格检查：全身皮肤、巩膜可见黄染，余无阳性体征。入院后辅助检查：胆汁酸2.1 μmol/L，ALT 12 U/L，AST 23 U/L，ALP 309 U/L，GGT 11.0 U/L，总胆红素340.0 μmol/L，直接胆红素23.1 μmol/L。血常规均正常。网织红细胞、触珠蛋白正常。病毒性肝炎、自身免疫性肝病和肝豆状核变性的相关检测均为阴性。腹部超声与磁共振成像未显示任何异常。综合患者病情，考虑Crigler-Najjar综合征Ⅱ型。予以苯巴比妥诱导试验，后复查肝功能：胆汁酸1.8 μmol/L，ALT 11 U/L，AST 21 U/L，ALP 256 U/L，GGT 13.0 U/L，总胆红素220.6 μmol/L，直接胆红素19.1 μmol/L。

同时对黄疸相关基因进行序列分析，用乙二胺四乙酸抗凝管抽取患者外周静脉血2 ml。采用QIAamp DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)抽提基因组DNA，并测量其吸光度值及浓度。提取的DNA用DNA酶片段化后采用磁珠法进行纯化，随后进行PCR扩增并连接上接头序列，经定制的Panel探针(illumina Inc,USA)两次捕获及纯化，再经PCR扩增和纯化后获得的最终文库在NextSeq500测序仪(illumina Inc,USA)上对Panel相关基因的外显子区进行测序。所有测序数据结果采用BWA软件与参考序列(UCSC hg19)进行比对，采用仪器默认设置[1]，使用文献[2]报道方法对数据进行注释。经筛选流程筛选，并结合患者临床资料和生物信息学软件(PolyPhen2、LRT、Mutation Taster等)预测结果，对各个基因的功能、变异情况以及遗传模式进行分析，得到可疑候选突变。对可疑候选突变的位点设计PCR引物进行扩增及进行Sanger测序验证。

最终发现了UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)1A1基因的两个突变。一个是在第1外显子的核苷酸位置211处用A取代G(c.211G>A)，导致UGT1A1酶的密码子71处的甘氨酸(G)变为丙氨酸(R)(p.G71R)(图1)。第二个是第5外显子的核苷酸位置1456处的T至G的转换(c.1456T>G)，导致密码子486处的酪氨酸(Y)被天冬氨酸(D)取代(p.Y486D)(图2)。在其他外显子中均未检测到突变。经过UGT1A1全编码子测序突变分析，最终明确诊断为Crigler-Najjar综合征Ⅱ型。

2 讨论

遗传性非结合性高胆红素血症的分类是基于历史中相关的两个报告。Gilbert综合征(Gilbert syndrome，GS)最初是在1901年被报道为一种家族性非溶血性良性高胆红素血症[3]。1952年，Crigler和Najjar独立报道了可以引起核黄疸的严重家族性非结合性高胆红素血症[4]，并将先天性家族非结合性高胆红素血症分为两组：先天性家族性非溶血性高胆红素血症伴核黄疸和家族性非溶血性良性高胆红素血症。1969年，Arias等[5]将黄疸严重并对苯巴比妥无反应的一类作为Crigler-Najjar综合征 Ⅰ 型(Crigler-Najjar syndrome，CNS-Ⅰ)，黄疸良性并对苯巴比妥有反应的一类作为CNS-Ⅱ。

UGT是一种结合在内质网上的膜蛋白，在把葡萄糖醛酸从UDP-葡萄糖醛酸转移到其他分子上的过程中起到催化作用。所以，它在胆红素的代谢中起着关键作用，可以提高受体分子的水溶性，从而促进了胆红素从体内通过胆汁和尿液排泄[6]。在人类中，UGT分为两个家族，UGT1和UGT2。UGT1家族包含9种功能酶(UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9和UGT1A10)和4种假基因(UGT1A2P、UGT1A11P、UGT1A12P和UGT1A13P)， 由2q37上的单个基因编码[7]。UGT1A1是唯一与胆红素代谢相关的酶，主要在肝脏中表达[6]。UGT1A1基因的遗传变异，导致酶活性的减少或缺失，进而导致不同程度的高非结合胆红素血症，包括前面提到的GS和CNS[8-10]。GS在不同种族间的相应突变和多态性上存在一定差异。其中在白种人和非洲人中，大多数GS是TATA盒启动子变异UGT1A1*28[11]。但在东亚，包括日本、中国和韩国，UGT1A1*6多态性是重要的原因[12-14]。而CNS-Ⅰ的基因突变可发生在UGT1A1的第1外显子，也可发生在第2～5外显子，CNS-Ⅱ的突变位点多在UGT1A1的第1、2、4、5外显子[10]。

图1 UGT1A1外显子l(Exon1)测序结果

图2 UGT1A1外显子5(Exon5)测序结果

不同的突变位点，导致酶活性减少或缺失的程度不同，进而对患者胆红素代谢水平产生不同的影响。该类疾病应该对肝葡萄糖醛酸转移酶水平进行测定，从而做相应的诊断。但真正临床实施存在一定困难，临床上该类疾病的鉴别主要还是以患者的临床表现以及胆红素水平为诊断依据。GS患者通常胆红素升高程度较低(20～80 μmol/L)，临床上无需特殊干预，定期随访胆红素水平即可。CNS-Ⅰ型的总胆红素水平通常超过正常范围的25倍(342～684 μmol/L)，在严重的CNS-Ⅰ中，UGT1A1活性完全缺乏导致遗传性高非结合胆红素血症，同时可能引起胆红素脑病(核黄疸)，这类患者并无特殊有效的治疗方案，最终需行肝移植并且预后差。但CNS-Ⅱ患者由于酶活性仍部分存在(10%)，总胆红素水平通常在正常范围的6～25倍(103～342 μmol/ L)[15]，这类患者可以存活至成年[16]，严重时可予以苯巴比妥治疗，将胆红素控制在合适的水平，适当时可逐步停药[17-19]。

在本文中，笔者发现该高非结合胆红素血症的藏族女孩具有UGT1A1基因中的两个突变组成的复合杂合突变(p.G71R和p.Y486D)。根据病史，以及临床生化和遗传学的发现，临床上给予CNS-Ⅱ的诊断。根据既往相关研究结果，在p.G71R和p.Y486D的单一纯合子中，UGT1A1活性分别为野生型活性的(32.2±1.6)%和(7.6±0.5)%。p.G71R和p.Y486双纯合子的酶活性为(6.2±1.6)%，而G71R的杂合子活性为(60.2±3.5)%[20-21]。p.G71R多态性是亚洲人群中最常见的GS的遗传原因，突变频率为11%～21%。p.Y486D的错义突变既往在日本和中国的CNS-Ⅱ患者中报道。在先前报道的CNS-Ⅱ病例中，p.Y486D和p.G71R经常在同一时间观察到杂合或纯合子突变[18-19,21-22]。p.G71R突变并不会导致UGT1A1活性明显降低，疾病程度一般较轻。而由于第5外显子的p.Y486D突变会影响所有从UGT1家族表达的亚型(从UGT1A1到1A10)的葡萄糖醛酸化，所以p.Y486D突变是较严重的。

综上所述，第1外显子和第5外显子可能是亚洲人群中UGT1A1基因的热点突变区域，而p.G71R和p.Y486D是导致UGT1A1遗传相关的高非结合胆红素血症的两种最常见突变。对于原因不明的高非结合胆红素血症，应进行UGT1A1基因分析，特别是第1外显子和第5外显子区域的分析。对具有特殊基因型的患者，尤其包括家庭成员的相关基因分析可以帮助了解疾病的基因型与表型的联系以及进行临床诊断。