和丽，郭楚雅，王雪峰，2，*，普岳红，2，范江平，2，黄艾祥

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201；2.云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南昆明650201）

随着社会的发展和进步，人们对乳及乳制品的需求量不断增加。当前我国在营养层面对乳及乳制品进行研究的同时，也对其风味进行了研究[1]。发酵乳是乳制品中的一种，是以牛乳或乳粉为原料，发酵后制成的pH值降低的产品[2-3]，其可分为酸乳和风味发酵乳[4]。发酵乳具有丰富的营养和良好的保健功能[5-6]，并以其独特的风味、极高的营养价值受到越来越多人的喜爱[7]。它可以促进人体对蛋白质的吸收，帮助乳糖不耐症患者食用牛奶，减少胀气、腹泻等症状[8]，还可以助消化，润肠通便且热量低又不会胖[9]。然而，目前国内外对调味料型发酵乳的研究鲜有报道，其作为一种新型发酵乳可以进一步丰富发酵乳的种类。本试验以鲜牛乳、香辛料为原料，利用实验室自制贯筋藤蛋白酶酶解牛乳[10]，脱去乳清，并以感官评分为指标，利用单因素试验和响应面分析法优化脱乳清风味调料乳发酵工艺条件，开发出一款独具香辛料风味、食用方式多样性的脱乳清调料乳，为特色发酵乳产业的开发提供一定的理论应用参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳、乳清蛋白粉、贯筋藤蛋白酶（酶活力为223.135U/mL）、商业直投式酸奶发酵剂（DELVO-YOG?FVV-231DSL直投式菌种）：由云南农业大学食品科学技术学院实验室提供；白砂糖、黑胡椒粉、生姜粉、花椒油、辣椒油、海盐：市售。

MRS 肉汤培养基、NaOH、酚酞、K2SO4、CuSO4、HCl、H2SO4、甲基红-溴甲酚绿指示剂、异戊醇：天津市凤船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SVJ-358型智能商用型酸奶机：北京世纪阳光科技发展有限公司；HPX-9272ME型恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；SW-CJ-IF型单人双面超净无菌操作台：苏州江东精密仪器有限公司；GMSX-280型压力蒸汽灭菌器：北京市永光明医疗仪器有限公司；雷磁PHSJ-4A型实验室pH计：上海精密科学仪器有限公司；HJJ-6恒温水浴锅：常州华奥仪器制造有限公司；NDJ-4型旋转黏度计：武汉格莱莫检测设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺设计

生鲜乳→验收→预热→均质→凝乳→切块→脱乳清→添加香辛调味料→搅打→灭菌→冷却→接种→发酵→冷藏后熟→成品。

1.3.2 感官评价

组织12位具有一定专业知识的人员经培训组成评价小组，进行感官评分，根据色泽（25分）、气味（25分）、组织状态（25分）、整体口感（25分）4个方面对风味调料乳进行评定，最后得分为12位评分员评分的算术平均值。感官项目权重的分布见表1。

表1 脱乳清风味调料乳感官评定评分表Table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

续表1 脱乳清风味调料乳感官评定评分表Continue table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

1.3.3 香辛料质量比对脱乳清风味调料乳感官品质的影响

以脱乳清风味调料乳感官评分值为指标，参考美式凯撒、法式酱、千岛酱等沙拉酱品种及我国居民口味，选用花椒油、辣椒油、海盐、黑胡椒、生姜粉作为原材料[11]，以生姜粉添加量（g）作为基准项，按以上排序的不同比例添加到脱乳清发酵乳中，筛选出最佳香辛料质量比。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 凝乳酶添加量对产品感官品质的影响

贯筋藤凝乳功能成分为一种复合蛋白酶，主要是分子量为24 kDa的半胱氨酸蛋白酶B，该酶具有耐高温、耐酸碱性能较好、凝乳活力较高等酶学特性[12]。以感官评分为指标，考察贯筋藤凝乳酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）对脱乳清风味调料乳感官评分的影响。

1.3.4.2 白砂糖添加量对产品感官品质的影响

以感官评分为指标，考察白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）对脱乳清风味调料乳感官评分的影响。

1.3.4.3 发酵时间对产品感官品质的影响

以感官评分为指标，考察发酵时间（6、8、10、12、14、16 h）对脱乳清风味调料乳感官评分的影响。

1.3.4.4 乳清蛋白粉添加量对产品感官品质的影响

以感官评分为指标，考察乳清蛋白粉添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）对脱乳清风味调料乳感官评分的影响。

1.3.5 响应面试验因素水平表

在单因素试验的基础上，利用响应面Box-Behnken试验设计，以感官评分为响应值，选取感官评分影响较为显著的A凝乳酶添加量（%）、B白砂糖添加量（%）、C发酵时间（h）、D乳清蛋白粉添加量（%）4个因素，进行四因素三水平的试验设计，优化脱乳清风味调料乳的工艺参数。响应面分析因素及水平见表2。

表2 响应面试验分析因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 产品理化及微生物指标测定方法

1）酸度的测定：参照GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[13]进行测定。

2）蛋白质的测定：参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[14]进行测定。

3）脂肪的测定：参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[15]进行测定。

4）微生物指标的测定：参照GB 4789.18-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品》[16]进行测定。

2 结果与分析

2.1 不同香辛料质量比对脱乳清风味调料乳感官品质的影响

不同香辛料质量比对脱乳清风味调料乳感官品质的影响见图1。

图1 不同香辛料质量比对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.1 Effect of different spice ratio on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由图1可知，根据工艺设计经过多次重复试验确定每千克牛奶中添加花椒油12 g、辣椒油10 g、海盐8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g，即香辛料质量比为6∶5∶4∶2∶1的感官评分最高，该条件下制成的脱乳清风味调料乳质地均匀、香辛料风味较佳。

2.2 脱乳清风味调料乳的单因素试验

2.2.1 凝乳酶添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响

凝乳酶添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响见图2。

图2 凝乳酶添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.2 Effect of the amount of rennin added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

凝乳酶[17]添加量在脱乳清风味调料乳的制备过程中至关重要，是脱乳清风味调料乳组织状态的主要影响因素。由图2可以得出：感官评分在凝乳酶添加量为0.4%时最高，但之后随着凝乳酶添加量的增加而下降，发酵乳口感干涩、带有苦味，可能是贯筋藤凝乳酶本身含有的涩味随添加量的增加而愈加苦涩，且影响发酵乳中的组织状态，对发酵乳的感官品质有所影响[18]。因此，选取最佳凝乳酶添加量为0.4%。

2.2.2 白砂糖添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响

白砂糖添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响见图3。

图3 白砂糖添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.3 Effect of the amount of white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由图3可以得出，随着白砂糖添加量的增加，脱乳清风味调料乳的感官评分逐渐升高之后有降低的趋势，当白砂糖添加量为4%时，风味调味乳的感官品质最高，感官评分为81.5分，白砂糖可以为调料乳中乳酸菌的生长繁殖提供丰富的碳源，还可以作为甜味剂，赋予调料乳更好的风味。当白砂糖添加量较低时，乳酸菌的繁殖能力较低，并且产酸和产风味物质的能力较弱；当白砂糖添加量过高时，酸奶中的甜度突出，抑制了乳酸菌的生长繁殖[19]，因此导致调料乳酸甜口感消失且不符合当代人们饮食的健康性，对发酵乳的感官品质有所影响[20]。降低了风味调料乳的感官品质。故白砂糖最佳添加量为4%。

2.2.3 发酵时间对脱乳清风味调料乳感官品质的影响。

发酵时间对脱乳清风味调料乳感官品质的影响见图4。

图4 发酵时间对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由图4可以得出，随着脱乳清风味调料乳发酵时间的延长，脱乳清风味调料乳发酵在不断进行，感官评分呈上升趋势，但在发酵14 h后，脱乳清风味调料乳的感官评分开始降低；前期可能是因为发酵时间过短，调料乳酸度不足且不凝固，而后期随着发酵时间延长，调料乳酸味过重，遮盖了脱乳清风味调料乳的风味，影响脱乳清风味调料乳的滋味[21]。故选取最适发酵时间为14 h。

2.2.4 乳清蛋白粉添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响

乳清蛋白粉添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响见图5。

图5 乳清蛋白粉添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.5 Effect of the amount of whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由图5可以得出，脱乳清风味调料乳的感官评分随着乳清蛋白粉添加量的增加而先上升后下降，乳清蛋白粉添加量在0.6%处达到最大值。随着乳清蛋白粉添加量的增加，脱乳清风味调料乳的感官评分反而降低，可能因为乳清蛋白粉过高，导致发酵乳的风味、口感下降，且发酵乳组织状态过于凝固[22]，香辛调味料搅拌后分布不均匀，影响了感官评分。故选取最适乳清蛋白粉添加量为0.6%。

2.3 响应面优化脱乳清风味调料乳生产工艺

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，建立Box-Behnken Design中心组合设计试验模型，通过拟合二次方程计算最优工艺组合以及脱乳清风味调料乳最大理论值。选择凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵时间（C）和乳清蛋白粉添加量（D）进行四因素三水平响应面试验，试验结果见表3。

表3 响应面分析方案及结果Table 3 Response surface analysis and results

2.3.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对表3进行多元回归拟合，分别对脱乳清风味调料乳生产工艺条件凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵时间（C）和乳清蛋白粉添加量（D）进行试验数据分析，回归模型的方差分析结果见表4。

表4 方差分析结果Table 4 Variance analysis results

由表4方差分析可知，感官评分回归模型显著性检验P＜0.000 1，说明二次多元回归模型极显著；感官评分回归模型失拟性检验P=0.362 9＞0.05，可以认为所选脱乳清风味调料乳感官评分二次回归模型与实际试验拟合性充分模型失拟不显著。脱乳清风味调料乳感官评分回归诊断表明，决定系数R2=84.10%，说明脱乳清风味调料乳感官评分的变化有84.10%源于凝乳酶添加量、白砂糖添加量、发酵时间和乳清蛋白粉添加量；信噪比=7.301，这表明方程的拟合度和可信度均很高，可用于脱乳清风味调料乳感官评分评价。离散系数C.V为标准差与均值的比值，表示试验本身的精确度，C.V值越低，试验的可靠性越高[22]，本试验产品感官评分拟合C.V值为3.62%，可靠性较高。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确的分析和预测脱乳清风味调料乳感官评分，说明试验操作可信度高，具有一定的实践指导意义。由回归系数显著性表明，在所取因素水平范围内，各因素对脱乳清风味调料乳感官评分影响的顺序为：发酵时间（C）＞凝乳酶添加量（A）＞白砂糖添加量（B）＞乳清蛋白粉添加量（D）。

2.3.3 响应面优化

图6～图8是响应面变化三维曲面，可直观地反映脱乳清风味调料乳中凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵时间（C）和乳清蛋白粉添加量（D）交互作用对感官评分的影响。当等高线呈圆形时表示两因素交互作用不显著，而呈椭圆形或马鞍形时则表示两因素交互作用显著[23-24]。

图6 凝乳酶添加量、白砂糖添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.6 Effect of the amount of rennin added and white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

图7 白砂糖添加量、乳清蛋白粉添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.7 Effect of the amount of white sugar added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由图6～图8可知，A与B，B与D，A与D之间对脱乳清风味调料乳感官评分影响较大。脱乳清风味调料乳感官评分随脱乳清风味调料乳凝乳酶添加量及白砂糖添加量的增加而呈先上升后降低的趋势，凝乳酶添加量及白砂糖添加量为0.4%及4%时，脱乳清风味调料乳的感官评分值最大，与单因素和方差分析结果相符；由图7可知，脱乳清风味调料乳感官评分随脱乳清风味调料乳白砂糖添加量和乳清蛋白粉添加量的增加而呈逐渐升高后下降的趋势，白砂糖添加量及发酵时间为4%及0.6%时，脱乳清风味调料乳的感官评分值最大，交互作用显著和方差分析结果一致；由图8可知，脱乳清风味调料乳感官评分随着脱乳清风味调料乳凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量的增加感官评分呈先上升后降低的趋势，凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量为0.4%及0.6%时，脱乳清风味调料乳的感官评分值最大，与单因素和方差分析结果一致。

2.3.4 最佳条件确定和回归模型验证

回归模型通过响应面分析法得到最优脱乳清风味调料乳工艺条件，并根据设备情况对相关参数进行调整，对脱乳清风味调料乳最佳工艺条件进行验证试验，结果如表5所示。

图8 凝乳酶添加量、乳清蛋白粉添加量对脱乳清风味调料乳感官品质的影响Fig.8 Effect of the amount of rennin added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

表5 脱乳清风味调料乳最佳工艺条件验证Teble 5 Verification of the optimum technological conditions for de-whey flavor seasoning fermented milk

由表5可知，回归模型通过响应面法得到最优脱乳清风味调料乳工艺条件为凝乳酶添加量0.41%，白砂糖添加量3.87%，发酵时间14.4 h，乳清蛋白粉添加量0.58%。考虑实际操作情况与设备参数状况，确定脱乳清风味调料乳最佳工艺条件为：凝乳酶的添加量0.4%，白砂糖添加量4%，发酵时间14 h，乳清蛋白粉添加量0.6%，在上述最佳条件下进行验证试验，得到脱乳清风味调料乳的感官评分值为86.15±1.37，与理论值85.250 3接近。

2.4 产品理化和卫生指标

产品理化和卫生指标见表6。

表6 理化和卫生指标Table 6 The chemical and health indicators

由表6可得出，脱乳清风味调料乳的酸度约为90°T、蛋白质含量约为7.79%、脂肪含量约为5.16%、黏度为 7 300 mPa·s、活菌数约为 3.8×107CFU/mL，大肠菌群未检出，各项指标均符合GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》要求。

3 结论

本试验采用直投式菌种作为脱乳清风味调料乳的发酵剂，通过单因素试验及响应面优化脱乳清风味调料乳的最佳生产工艺条件为香辛料质量比为6∶5∶4 ∶2 ∶1（花椒油 12 g、辣椒油 10 g、海盐 8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g）、凝乳酶添加量0.4%、白砂糖添加量4%、发酵时间14 h、乳清蛋白粉添加量0.6%。该条件下生产的产品各项理化指标为蛋白质含量7.79%、脂肪含量 5.16%、酸度 90 °T、黏度为 7 300 mPa·s、活菌数约为3.8×107CFU/mL，且产品色香味俱佳、蛋白质丰富、口感浓郁，且风味独特、具有香辛料气味。脱乳清风味调料乳的研究，为特色发酵乳产业的开发提供一定的理论应用参考。