蒙秋艳，黄靖洲，梁艳玲，滕艳芳，伍彦华

（广西轻工业科学技术研究院有限公司，广西南宁530001）

粉葛为豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，野葛即葛根，为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。在 2005 年之前，野葛和粉葛均视为葛根药材，自《中国药典》2005年版起，为了用药的准确性，将二者按照药材来源进行区分，列为葛根和粉葛2个品种[1-2]。目前为止，民间用药仍习惯将二者都作为葛根药材进行使用，同时粉葛常作为普通食品食用。粉葛和野葛是我国最主要的葛属植物，产于我国西南部、中南部至东南部，除新疆、青海及西藏外，几乎遍布全国[3]。其中粉葛以人工种植为主，主要产地为两广、云南一带[4]。我国的葛根类年资源总量在150万吨以上，小部分用以制作中药材、淀粉加工、食品加工，而仍有很多葛根资源没有被很好地开发和利用[5]。

近年来，国内外研究人员针对葛根的多糖类、异黄酮类成分的研究投入了大量工作。其中，Zhou Dong等[6]从葛根中分离得到一种分子量为12.3 kDa的新型多糖，并分析其结构，发现该多糖的主要连接类型是1，4-α-D-Glcp 和 1，3，6-α-D-Glcp，药理研究表明此新型多糖具有免疫调节活性。Wang Xin等[7]从野葛中分离并鉴定了3种异黄酮葡萄糖基转移酶，分别含有野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4、PlUGT15和PlUGT57，发现其能在体外将金雀异黄素和大豆苷元的7-羟基糖基化，其中PlUGT15对染料木素和大豆苷元的催化效率高于黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶。Sun Yingjie等[8]从野葛中分离得到2种新的异黄酮苷类化合物，分别为3'-甲氧基新鸟苷A和3'-甲氧基新鸟苷B，活性评价显示其对HepG2细胞具有保护作用，表明其具备一定的保肝活性。对于葛根的生物活性研究，也有新发现。Wang Xiaoke等[9]使用改良的热解方法合成了一种具有治疗痛风的临床应用前景的新型水溶性碳点，命名为Puerariae lobatae Radix CDs，药效试验研究表明其具有良好的生物相容性和抗痛风的生物活性。

传统中医学理论中，粉葛和野葛具有发表解肌、解热生津、透疹、升阳止泻、解酒的功效[10]，现代药理研究表明葛根具有改善心脑血管[11-12]、降糖[13-14]、降脂[14-15]、降压[16]、保肝[8，17-18]的作用，以上作用功效在临床研究中也得到验证[19-21]。野葛和粉葛被卫生部先后加入药食同源目录中，我国对于葛根的开发利用将会越来越深入。广西地区的葛根原料产量大，多以新鲜原料或葛粉的形式以批发或零售的方式进行销售，处于农产品产业链底端，对葛根的开发利用仍处在低层次的粗加工阶段，大大制约了广西农产品升值，这一现状亟待改变。本研究通过对广西不同产地的粉葛、野葛原料的多糖、异黄酮进行含量测定，对其品质进行评价，作为广西所产葛根进一步综合开发利用的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粉葛、野葛：收集自广西各地，详见表1；三氯化铝、无水乙醇、硫酸（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；乙酸钾、苯酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；D-无水葡萄糖对照品（纯度≥99.9%）、芦丁、大豆苷（纯度均≥95%）：中国食品药品检定研究院；葛根素（纯度≥95%）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇（色谱纯）：德国默克公司；纯化水：广西轻工院有限公司科技中心实验室自制，符合GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

表1 粉葛、葛根原料来源一览表Table 1 List of raw materials of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata

1.2 仪器与设备

N4S紫外分光光度仪：上海仪电分析仪器有限公司；202-2电热恒温干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；XO-SM300超声波微波协同反应工作站：南京先欧仪器制造有限公司；AUW220电子天平：岛津（上海）实验器材有限公司；Genex Beta 移液枪（10 μL～1 000 μL）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Waters2489高效液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；针式过滤器有机滤头（0.22、0.45 μm）：天津市津腾实验设备有限公司；LHP-60-H实验室纯水机：重庆力德高端水处理设备研发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水分含量的测定

分别称取不同产地的粉葛、野葛粉末（过40目筛）约5 g，按照《中国药典》2015年版四部中“0832水分测定法”第二法（烘干法）规定的方法，分别测定广西9个产地粉葛和野葛的水分含量。

1.3.2 多糖含量的测定

粉葛、野葛中多糖的含量使用苯酚-硫酸法[22]进行测定。

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

称取葡萄糖对照品，制成含量为107mg/mL标准葡萄糖溶液。准确移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的标准葡萄糖溶液，按照苯酚-硫酸法进行操作，在λ=490 nm下测量吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

葡萄糖标准曲线的回归方程为y=0.0093x+0.0307，r2=0.999 1，该曲线在葡萄糖质量浓度为21.40 mg/mL～107.00 mg/mL范围内线性关系良好。

1.3.2.2 粉葛、野葛多糖待测样品的制备

准确称取1.0 g各产地粉葛、野葛样品粉末（40目），在液料比40∶1（mL/g）条件下，以一定温度水浴条件下热水浸提一定时间，过滤，滤渣用热水洗涤3次，再以同等条件进行第二次提取，合并两次提取液；提取液减压浓缩后按照体积比1∶3加入体积分数为95%乙醇溶液，低温静置24 h，离心取沉淀，加水复溶后定容至50 mL，再准确移取0.5 mL定容到50 mL，即得多糖待测样品。

1.3.2.3 粉葛、野葛样品的多糖含量测定

移取1.3.2.2所制得待测样品2.0 mL于具塞试管中，加入苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，在λ=490 nm下测量吸光度，根据回归方程计算样品溶液中葡萄糖的质量浓度。

样品中多糖含量以质量分数ω计，单位以g/100 g表示，按公式（1）计算。

式中：m1为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，μg；V1为样品定容体积，mL；m2为样品质量，g；V2为比色测定时所移取样品测定液的体积，mL；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.3.3 总异黄酮含量的测定

1.3.3.1 供试样品的制备

取9个不同产地供试样品粉末（40目），准确称取0.1 g，加入体积分数为70%的甲醇溶液50 mL，水浴回流提取30 min。冷却至室温（25℃）后补足质量，摇匀，过滤取续滤液，即得总黄酮供试品溶液。每个产地的供试品溶液平行制作3份。

1.3.3.2 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准对照品，用70%甲醇溶解后定容至1 000 mL，配置成0.057 3 mg/mL的芦丁标准溶液。分别准确移取芦丁标准溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于10 mL容量瓶中，加入2 mL三氯化铝溶液（0.1 mol/L）和 3 mL乙酸钾溶液（1 mol/L），并用70%甲醇定容至刻度，摇匀后静置30 min。同时做空白样。使用紫外可见分光光度仪，在波长为420 nm条件下检测，记录吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。芦丁标准曲线的回归方程为y=4.112 0x-6.590 0，r2=0.999 6，该曲线在芦丁浓度为0.001 4 mg/mL～0.022 9mg/mL范围内线性关系良好。

1.3.3.3 供试样品中总异黄酮含量的测定

分别准确移取1.3.3.2所制备的供试样品溶液1.0 mL，加入2 mL三氯化铝溶液（0.1 mol/L）和3 mL乙酸钾溶液（1 mol/L），并用70%甲醇定容至10 mL，摇匀后于室温（25℃）静置30 min，用0.45 μm滤膜过滤，于波长420 nm处测定吸光度值，计算总异黄酮的浓度。

样品中总黄酮含量以芦丁的质量分数ω总异黄酮计，单位以g/100 g表示，按照公式（2）计算。

式中：C为从芦丁标准曲线查得供试样品中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取样品溶液体积，mL；d为供试样品的总稀释倍数；m为取样量，g；F为原料的水分含量，%。

1.3.4 葛根素和大豆苷的含量测定

1.3.4.1 色谱条件

ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=26∶74，等度洗脱；检测波长为250 nm；洗脱流速为1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.4.2 对照品溶液的配置

将20 mg葛根素标准对照品用甲醇完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，作为葛根素标准对照储备液；将20 mg大豆苷标准对照品用甲醇完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，作为大豆苷标准对照储备液。

分别吸取1.00 mL葛根素标准对照储备液和770.00 μL大豆苷标准对照储备液，定容到100 mL容量瓶中，配制成含0.008 0 mg/mL葛根素和0.006 2 mg/mL大豆苷混合标准对照液，用0.22 μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

1.3.4.3 供试样品的制备

取9个不同产地供试样品粉末，准确称取1 g，各称3份，加入适量体积分数为40%的乙醇溶液，使液料比为40∶1（mL/g），在50℃温度条件下提取60 min。过滤，准确吸取续滤液50 μL定容至5 mL，然后用0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3.4.4 供试样品的检测与计算

将1.3.4.2和1.3.4.3所制备的对照品溶液和供试品溶液使用高效液相色谱法进样检测，检测方法如1.3.4.1所示。以对照品溶液中葛根素、大豆苷的保留时间为参考，确定供试品的葛根素和大豆苷色谱峰，记录其峰面积并进行计算。

样品中葛根素、大豆苷含量以质量分数ω葛、ω苷计，单位以 mg/g表示，按公式（3）、（4）计算。

式中：C葛为从标准曲线上查得供试样品中葛根素浓度，mg/mL；V 为提取样品溶液体积，mL；m'为取样量，g；C苷为从标准曲线上查得供试样品中大豆苷浓度，mg/mL；F为原料的水分含量，%。

1.3.4.5 线性关系考察

从1.3.4.2所配置的葛根素、大豆苷标准对照储备液中吸取适量溶液，制成含量分别为0.001 6、0.003 2、0.004 8、0.006 4、0.008 0、0.009 6 mg/mL 的葛根素标准溶液，以及含量分别为 0.001 2、0.002 5、0.003 7、0.005 0、0.006 2、0.007 4 mg/mL的大豆苷标准溶液。对以上不同浓度的标准对照溶液进行检测，检测方法如1.3.4.1所述，以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，制作标准曲线。

葛根素标准曲线的回归方程为Y=4.31×10-7X－2.02×10-3，其 r2=0.999 9，说明葛根素标准曲线在葛根素含量为0.001 6 mg/mL～0.009 6 mg/mL范围内线性关系良好；大豆苷标准曲线公式为Y=4.46×10-7X+1.51×10-3，其r2=0.999 9，大豆苷标准曲线在大豆苷含量0.001 2 mg/mL～0.007 4 mg/mL范围内线性关系良好。

1.3.4.6 精密度考察

取1.3.4.2制得的对照品溶液重复进样6次，用1.3.4.1方法检测，测得葛根素、大豆苷的峰面积，计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度。

1.3.4.7 重复性考察

选取9号产地（广西桂林市）粉葛进行试验，准确称取1 g粉末，称6份，按照1.3.4.3的提取方法制备，即制得重复性试验供试液。用1.3.4.1方法检测，记录葛根素、大豆苷的峰面积，计算其RSD值，考察其重复性。

1.3.4.8 稳定性考察

取1.3.4.3所制备的供试样品溶液1份，相隔0、2、4、6、8、10 h 进样，进行稳定性考察，记录葛根素、大豆苷的峰面积，计算其RSD值。

1.3.4.9 加样回收试验

准确称取9号产地粉葛粉末6份，每份0.5 g，每份加入1 mL混合对照品溶液（含葛根素4.648 5 mg/mL和大豆苷0.675 1 mg/mL），按照1.3.4.3方法制备，即制得加样回收试验供试液。测定并计算葛根素、大豆苷的平均回收率和RSD值。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 乙醇体积分数

准确称取9号产地粉葛粉末1 g，分别加入体积分数为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，液料比控制为50∶1（mL/g），提取温度控制在40℃，超声波辅助提取30min。过滤，准确移取续滤液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm滤膜过滤，按照1.3.4.1所示方法进行检测，记录葛根素、大豆苷峰面积，计算其提取率。

1.3.5.2 液料比

准确称取9号产地粉葛粉末1 g，加入体积分数为50%的乙醇溶液，提取温度控制40℃，于液料比分别为 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1、45 ∶1、50 ∶1（mL/g）条件下超声波辅助提取 30 min。过滤，准确移取续滤液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm滤膜过滤，按照1.3.4.1所示方法进行检测，记录葛根素、大豆苷峰面积，计算其提取率。

1.3.5.3 提取时间

准确称取9号产地粉葛粉末1 g，加入体积分数为50%的乙醇溶液，液料比为50∶1（mL/g），提取温度控制 40 ℃，以提取时间分别为 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min进行超声波辅助提取。过滤，准确移取续滤液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm滤膜过滤，检测并记录葛根素、大豆苷峰面积，计算其提取率。

1.3.5.4 提取温度

准确称取9号产地粉葛粉末1 g，加入体积分数为50%的乙醇溶液，液料比为50∶1（mL/g），在提取温度分别为 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，进行超声波辅助提取30min。过滤，准确移取续滤液50 μL定容至5 mL，用0.22 μm滤膜过滤，检测并记录葛根素、大豆苷峰面积，计算其提取率。

1.3.6 正交试验

在单因素试验的基础上，考察乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度对葛根素和大豆苷的提取率的影响，设计L9（34）正交试验，正交试验因素水平表见表2。

2 结果与分析

2.1 广西不同产地粉葛、野葛的水分、总多糖和总异黄酮含量

9个不同产地的粉葛、野葛的水分含量、总多糖和总异黄酮含量的测定结果见表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 广西不同产地粉葛和野葛的水分、总多糖和总异黄酮的含量（n=3）Table 3 Contents of moisture，total polysaccharides and total isoflavones of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata from different origins of Guangxi（n=3）

各个产地的粉葛、野葛的水分含量均低于14%，符合《中国药典》对于葛根、粉葛药材饮片的水分含量规定，其中广西桂林市的粉葛的水分含量最低，为7.13%；各产地粉葛、野葛之间的多糖和总异黄酮含量均存在较大差异，产于广西玉林市的野葛多糖含量和总异黄酮含量最高，为1.106 0 g/100 g和5.163 0 g/100 g。

2.2 方法学考察

精密度考察结果显示，葛根素和大豆苷的RSD值分别为0.25%、0.64%，说明精密度良好；稳定性考察，葛根素和大豆苷成分的RSD值分别为0.39%、0.65%，表明样品溶液在10 h内稳定性良好；重复性考察，葛根素和大豆苷两种成分的RSD值分别为0.50%、0.87%，结果表明重现性良好。

加样回收试验结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery（n=6）

葛根素和大豆苷两种成分的加样回收率分别为97.37%、95.57%，其RSD值分别为0.49%、1.84%，结果表明，所建立的方法适用于粉葛、野葛中葛根素和大豆苷的含量测定。

2.3 单因素试验

不同乙醇体积分数对9号产地（广西桂林）粉葛的异黄酮提取效果见图1。

图1 乙醇体积分数对葛根素和大豆苷提取效果的影响Fig.1 The effect of content of ethanol on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素的提取曲线在乙醇体积分数为60%时达到峰值，但曲线趋势较缓，而大豆苷曲线在乙醇体积分数为50%时为峰值并在高于50%时呈急剧下降趋势，综合考虑，认为当乙醇体积分数为50%时，异黄酮的提取效果最佳。

不同液料比对9号产地粉葛的异黄酮提取效果见图2。

图2 液料比对葛根素和大豆苷提取效果的影响Fig.2 The effect of liquid material ratio on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲线变化趋势一致，在液料比为45∶1（mL/g）时达到峰值，表明在该条件下异黄酮的提取效果最佳。

图3为不同提取时间的异黄酮提取曲线。

图3 提取时间对葛根素和大豆苷提取效果的影响Fig.3 The effect of extraction time on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲线变化趋势基本相似，在提取时间低于45 min时，异黄酮的提取率变化不大，在提取时间为50 min时异黄酮的提取效果最佳。

不同提取温度对9号产地粉葛的异黄酮提取效果见图4。

图4 提取温度对葛根素和大豆苷提取效果的影响Fig.4 The effect of extraction temperature on extraction effect of puerarin and daidzein

葛根素和大豆苷的提取曲线变化趋势相似，当提取温度从40℃提升到50℃时，葛根素和大豆苷的提取率急剧升高并达到顶峰，高于50℃后平缓下降，表明在提取温度为50℃时异黄酮的提取效果最佳。

以上单因素试验结果显示，葛根中异黄酮成分的最佳提取因素分别为50%乙醇、液料比45∶1（mL/g）、提取时间50 min、提取温度50℃。

2.4 正交试验

基于单因素试验结果，对乙醇的体积分数、液料比、提取温度、提取时间4个因素进行L9（34）正交试验，结果见表5。

表5 正交试验结果（n=3）Table 5 Orthogonal test results（n=3）

续表5 正交试验结果（n=3）Continue table 5 Orthogonal test results（n=3）

由正交试验结果和极差分析可知，当以葛根素提取率为指标时，4个因素对工艺的影响效果为A＞D＞C＞B，其理论最优组合为A2B1C2D3，该组合恰好是正交试验实际最优组；以大豆苷的提取率为指标时，4个因素对工艺的影响效果为D＞B＞A＞C，其最优组合为A2B1C3D3。两个指标显示的结果，最优的提取温度存在差异，由于葛根中的葛根素含量远大于大豆苷的含量，并从节能方面考虑，本项目主要参考以葛根素的提取率为指标的分析结果。综上所述，最优的水平组合为A2B1C2D3，即最佳提取条件为使用40%乙醇作为提取溶剂，液料比控制在40∶1（mL/g），在50℃条件下超声辅助提取60 min。

3 结论

广西各个产地的粉葛、野葛的水分含量均低于14%，符合《中国药典》的规定，其中产于广西桂林的粉葛水分含量最低，为7.13%；产于玉林市的野葛多糖和总异黄酮含量较高，分别为1.106 0、5.163 0 g/100 g，该产地的野葛中所含葛根素和大豆苷含量最高，分别为41.767 5、5.788 4 mg/g。综合考察9个产地葛根原料的水分含量、多糖和总异黄酮含量，发现产于广西玉林市的野葛品质最佳。