魏婧薇，赵文超，王绍辉

(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

番茄因其果实风味独特、富含维生素和矿质元素等营养元素而被广受欢迎与喜爱，并且种植生产番茄是农民增收致富的重要途经[1,2]。然而，根结线虫(Meloidogynespp.)却是侵染植物的主要病原之一，其分布范围广泛[3]，其中番茄根结线虫病是影响番茄根部生长发育的最主要病害。当根结线虫入侵番茄根系后，在根部组织建立取食位点，形成肥肿畸形瘤状的根结，造成根系的输导组织被破坏，影响了水分和养分的正常运输，从而导致地上部生长不良，叶片逐渐黄化萎缩，果实脱落，产量下降[4]。

茉莉酸盐(Jasmonates，JAs)是除生长素、赤霉素(GA)、乙烯(ET)、细胞分裂素和脱落酸以外的一种新的植物激素[5]。茉莉酸对植物的生存发育具有及其重要的作用，它既可以调节植物根的生长、雄蕊发育、叶片衰老、表皮毛形成等生长发育过程，又可以帮助植物防御病原侵染、昆虫噬咬以及抵御干旱等胁迫影响[6]。根据目前研究报道可知，植物中的MYC类转录因子属于bHLH类转录因子家族，是茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子[7]。当茉莉基-异亮氨酸(JA-Ile)是激素的受体活性形式时，SCFCOI1-JAZ复合物充当JA-Ile的共受体，在稳定状态下，JAZ蛋白与MYC2相互作用并抑制后者的转录活性；当响应内部或外部刺激，升高的JA-Ile水平会促进JAZ阻遏物的SCFCOI1依赖性降解，从而激活JA响应基因的MYC2定向转录，以协调JA介导的创伤和病原体反应的激活[8][9]。另外，研究发现拟南芥中MYC2可以差异调节JA响应基因的两条分支，正向调节植物对伤害的反应和负调控植物对病原体感染的抗性反应[10]。

然而，番茄中有关茉莉酸信号转导调控番茄对南方根结线虫敏感性的研究相对较少，并且本试验室前人研究表明番茄茉莉酸合成突变体spr2较CM野生型株系和茉莉酸过表达35S::PS株系更容易感染根结线虫，甚至外源喷施茉莉酸甲酯可以提高番茄对根结线虫的抵抗力[11]。在本研究中以番茄茉莉酸信号转导途径中的MYC2为研究对象，首先对该基因做了基础的生物信息学分析，然后在接种南方根结线虫后对MYC2敲除株系(MYC2-CR)和野生型株系(CM)统计了根结指数、根结分级、线虫体宽等指标，初步探究了MYC2影响番茄对南方根结线虫敏感性。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要试剂设备

番茄材料为农业应用新技术北京市重点实验室自繁的番茄野生型CM株系(Solanumlycopersicumcv Castlemart)，以及纯合的MYC2CRISPR株系(MYC2-CR)。

试剂有次氯酸钠、乙醇、甲醛、二甲苯、甲苯胺蓝染液、熔点为54～56 ℃和56～58 ℃的石蜡、MS粉、植物凝胶、蔗糖、NaCl等化学试验试剂，以及PrimerSTAR MIX高保真克隆酶，Taq克隆酶、DNA胶回收试剂盒、植物RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒等生物试验试剂。仪器设备有电磁炉、恒温培养箱、切片机、烘片机、电热鼓风干燥箱、水浴锅、电子天平、高温灭菌锅、正置荧光显微镜等。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄MYC2的克隆与基础信息分析 首先利用MYC2的基因号Solyc08g076930.1从番茄基因库(https://solgenomics.net/)中BLAST得到其DNA、CDS序列，然后分别设计引物(F：ATGACTGAATACAGCTTGC，R：TTAGTGTGTTTCAGCAATTTTCGA)并从DNA、cDNA中克隆得到基因全长序列、CDS序列，利用MEGA5软件(https://www.megasoftware.net/)等进行基因结构分析、蛋白序列比对分析、进化树分析。

1.2.2 番茄的种植和管理 将番茄种子浸泡在55 ℃温水中3～5 h，接着用3%的次氯酸钠溶液消毒10～15 min，然后冲洗后将种子放至26 ℃培养箱中催芽至种子露白。再将露白的种子播种到装有草炭和蛭石2∶1混合基质的穴盘中，置于26～28 ℃/16～18 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培养室中培养出苗。当幼苗长到“两叶一心”时将其移入9 cm的营养钵中，按照同样的温光湿条件培养。

1.2.3 南方根结线虫的繁育与接种 在4～5片真叶龄番茄的根系周围接种定量的二龄幼虫，接种后35～50 d后，挑取收集植株根部的淡黄色卵块，置于26 ℃恒温黑暗培养箱中孵化，逐天收集孵化出的二龄幼虫，参考王绍辉等的方法[12]计算线虫密度，在距离植株根部1.5 cm左右处用1 mL移液器枪头打4个约2 cm深的小孔，均匀接种至总量为500头/株，对照组注入等量的清水，接种完成后在基质表面喷洒适量的水以保持湿润。

1.2.4 不同番茄株系根结指数及分级的统计 在不同番茄株系接种南方根结线虫7、14、21 d后，分别进行根结指数的统计。称取每株植株的根系鲜重并统计相应的根结数量，按照根结指数=根结数/根系鲜重计算根结指数(Gall Index)，每株系6株重复。在接种南方根结线虫第21 d时番茄株系根结大小代表性强、易于统计，根据根结线虫的根结分级标准对各株系根结进行分级，每株系6株重复。线虫根结短径分为7个级别：1级根结(0～0.5 mm) 2级根结(0.5～1.0 mm)、3级根结(1.0～1.5 mm)、4级根结(1.5～2.0 mm)、5级根结(2.0～2.5 mm)、6级根结(2.5～3.0 mm)、7 级根结(>3.0 mm)。

1.2.5 石蜡切片法观察根结线虫的发育及统计线虫体宽 具体参照李小曼[13]的方法,首先将取样的根结放入FAA固定液中过夜固定，依次加入不同梯度的乙醇脱水，脱水后用二甲苯溶液使根结透明化。将透明好的根结充分浸润石蜡，并使用熔融的石蜡包埋浸润好的根结，待充分冷却后进行切片，用0.1%甲苯胺蓝溶液染色。最后将染色后的载玻片用中性树胶封上盖玻片，待胶凝固后放在荧光正置显微镜下观察并测量统计线虫体宽，每个株系试验重复数50个。

用Office Excel做数据记录，采用SPSS多重比较法对试验数据进行差异显著性分析，最后采用Office Excel和PhotoShopCS6绘制图表。

2 结果与分析

2.1 番茄MYC2基因的生物学分析

对番茄中MYC2进行了基础信息分析。如图1-A所示，MYC2仅包含1个外显子，基因全长及CDS全长均为2070 bp，编码689个氨基酸残基。对MYC2进行系统发育树分析(图1-B)后发现，番茄SLMYC2与拟南芥中的ATMYC4有较进的进化关系，ATMYC3和ATMYC4是SLMYC2的同源基因，故推测番茄中SLMYC2可能也参与植物防御反应、次生细胞壁生物发生调控、转录调控等生物学功能。

A.番茄MYC2的基因结构分析； B.番茄MYC2的系统发育树分析

2.2 番茄中MYC2影响南方根结线虫入侵番茄后的根结数量

在CM和MYC2-CR株系接种南方根结线虫7、 14、21 d后分别进行取样分析，结果发现，MYC2-CR株系的根结指数显著低于CM对照株系(图2)。对接种南方根结线虫21 d 后的根结大小进行分级，结果表明MYC2-CR株系的2、3、4级根结远少于CM对照株系(图3)。因此说明在番茄中MYC2突变后可以显著减少由南方根结线虫侵染而形成的根结数量和根结大小。

图2 南方根结线虫入侵不同天数后番茄株系根结数量统计，*P<0.05

图3 南方根结线虫入侵不同天数后番茄株系根结分级，*P<0.05，** P<0.01

2.3 MYC2突变可以抑制南方根结线虫入侵番茄后的生长发育

接种南方根结线虫后，在前期7 d时、后期21 d时分别对CM和MYC2-CR两个株系进行根结取样与石蜡切片观察。结果表明(图4和图5)，接种南方根结线虫后MYC2-CR株系中的根结线虫体宽在7 d和21 d时均相比于CM株系小，尤其在接种21 d后MYC2-CR株系的统计结果相比于CM株系显著减少。综上可知，番茄中MYC2突变后对南方根结线虫入侵后的生长发育具有一定的抑制作用。

▲.巨细胞；★.根结线虫

图5 CM和MYC2-CR株系中南方根结线虫的线虫体宽比较(*P<0.05)

3 讨 论

本试验以番茄CM野生型株系和MYC2敲除株系为材料，初步探究了番茄中MYC2调节番茄对南方根结线虫敏感性的影响。在接种南方根结线虫后，对线虫根结进行数量和大小统计后发现MYC2敲除株系的根结数量和大小均比CM野生型株系少；通过石蜡切片观察分析根结内线虫的生长发育情况后可知，MYC2敲除株系根结内的线虫生长发育较野生型株系缓慢。综上结果，MYC2敲除株系可以提高番茄对南方根结线虫的抗性并且对南方根结线虫的生长发育也具有一定的抑制作用。

在本试验中探究出番茄中MYC2可以负向调节番茄对南方根结线虫的敏感性，而这种结果似乎与番茄中MYC2在茉莉酸信号转导途径中的作用并不相符。然而有研究发现MYC2转录因子在激素调控网络中扮演核心角色, 可以参与以JA为核心的多种激素互作过程[14]。此外，Xu等发现独脚金内酯(SLs)在番茄防御根结线虫中起到正调控作用，而在番茄中MYC2负调控番茄对根结线虫的防御反应，这可能是通过调节SLs、ABA和JA之间的激素交互来实现的[15]。Lorenzo等还发现在JA信号通路中，拟南芥中ATMYC2可以调节两个分支反应，分别是正向调控伤害相关基因的表达和负向调控病原菌相关基因的表达[16]。因此，我们推测番茄中MYC2的生物学功能具有多样性，可能通过多种激素交互反应来调控番茄对南方根结线虫的防御反应。综合来说，本研究直接证明了在番茄中MYC2可以负向调节番茄对南方根结线虫的敏感性，丰富了植物防御根结线虫的免疫机制。