李玉蓉 彭诚 柳丝瑶 单亮

【摘   要】 为了优化臭灵丹中异绿原酸B的提取工艺，在前期单因素试验对功率、时间、料液比、乙醇浓度四个影响提取因素比较的基础上，应用HPLC法测定含量，通过Box-Behnken实验对数据进行了响应面法分析。结果得出：异绿原酸B的最佳提取工艺为超声功率300w，超声时间51minn，料液比38：1 g/mL，乙醇浓度为74%，其得率为1.598%。

【关键词】 臭灵丹草;异绿原酸B;HPLC响应曲线法

中图分类号：R284.2             文献识别码：A               文章编号：2096-1073（2020）10-0034-36

[Abstract] In order to optimize the extraction process of iso-chlorogenic acid B from Odorant panacea， on the basis of the comparison of four factors affecting the extraction， namely power， time， solid-liquid ratio and ethanol concentration， HPLC method was used to determine the content， and response surface method was used to analyze the data through box-Behnken experiment. The results showed that the optimal extraction technology of iso-chlorogenic acid B was ultrasonic power 300w， ultrasonic time 51minn， solid-liquid ratio 38：1 g/mL， ethanol concentration of 74%， and yield of 1.598%.

[Key words] panacea purpurea; isochlorogenic acid B; HPLC response curve method

臭灵丹草，学名（Laggera pterodonta），在民间被称为臭叶子、大黑药等，为菊科翼齿六棱菊的全草，洗净后干燥入药。它是云贵川地区常见的中草药，其味苦、辛，性寒，具有非常高的药用价值，近年来逐渐应用于临床中，可治疗急性呼吸道感染、感冒和甲型H1N1流感等，对治疗多类病毒有明显功效。据相关研究发现，水提物中的二咖啡酰奎尼酸结构对单纯疱疹病毒Ⅰ型，单纯疱疹病毒Ⅱ型以及流感病毒ⅣA所致的细胞病变有抑制作用[1]。因此，探究臭灵丹中二咖啡酰奎尼酸的含量和功效具有重大意义，该试验主要针对臭灵丹中异绿原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）的提取工艺进行研究。

1  材料与方法

1.1  试验材料

臭灵丹草采于云南省石林彝族自治县周边;异绿原酸B标准品由成都曼思特公司购买;实验所需仪器、用具、试剂、药品等均由吉林农业科技学院制药工程实验室提供。

1.2  试验方法

1.2.1 HPLC化合物含量测定  HPLC条件：型号为Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6×150 mm，5 μm）;流动相为0.1%乙酸水（A）-甲醇（B）洗脱梯度 （0～5min，20%～35%B，5～13min，35%～50%B， 13～18min，50%～80%B，8～40min，80%～20%B），检测波长327 nm，柱温30℃，流速1.0 ml/min，进样量20 μL。

标准品的制备：在弱光线的环境下，分别取10mL棕色瓶放入标准品B 3.7 mg，加100%甲醇溶解并定容，制成每1mL含0.37mg的异绿原酸B溶液，置于2-8℃下待用。

供试品的配置：将臭灵丹粉末过40目筛，称取全草粉末1.000 g放入锥形瓶，倒入甲醇溶液至刻度线，准确称重，在功率300w、频率50kHz条件下，对药材进行超声处理1h，冷却后补充缺少重量，备用。

1.2.2 线性回归方程  标准品溶液移入25mL容量瓶中，分别加入甲醇溶液稀释至2、4、6、8、10 倍，定容后根据1.2.1方法进样测定峰面积，得出异绿原酸B的线性关系为：Y=97164440X-2184，线性范围0.02～0.10 mg/mL，R2=0.9998。

1.2.3 响应面因素水平设计  通过该试验前期阶段的单因素试验考察结果，选择出条件较好的三个水平，借助Box-Benhnken模型建立与分析四项因素，设计响应面试验因素及水平，见表1。

2  结果与分析

2.1  异绿原酸B的方差分析

借助Box-Benhnken模型，对异绿原酸B提取试验进行了Box-Behnken设计，针对结果分析得出响应面模型的回归方程：

Y1 =+1.558-7.75A+0.1001B+0.0332C-0.014D+0.0202AB+0.1307AC+0.0437AD+0.0425BC-0.0297BD-0.052CD-0.1259A2-0.1113B2-0.1412C2-0.1568D2

异绿原酸B的方差分析结果见表2。

由表2可得出，衡量控制组与实验组差异大小的P值小于0.01，Fb=22.15，表明模型拟合方程显著，根据两模型失拟项的方差分析，P>0.05，Fb=3.337，失拟项不显著，实验数值之间差异小，方程式可以完全反映实验的实际情况。试验所选模型的决定系数R2=0.9668，变异系数（C V%）=3.13，表明其拟合程度良好，测试误差较小，模型可用来分析与预测异绿原酸B的提取率，得出最佳超声功率300w、最佳提取时间51min、最佳料液比为38：1（g/mL）、最佳乙醇浓度为74%。

2.2  交互作用分析

异绿原酸B的交互影响见如图1。由图1的3D图可知响应面曲面的倾斜程度确定两者对响应面值的影响程度，说明两者之间的交互作用，AC（功率与料液比）的曲面倾斜的坡度最抖，表示功率与料液比的交互作用最显著;而图AB（提取时间与浓度）的曲面倾斜的坡度最缓，则提取时间与浓度的交互作用影響较小。

3  结论

本试验是建立在前期超声提取臭灵丹草中异绿原酸B单因素试验基础上，通过优化实验数据后，选择四因素中的三水平进行解析，根据 Box-Behnken设计，提取出异绿原酸B的成分，通过数据分析可知，异绿原酸B最佳提取条件为：最佳超声功率300w、最佳提取时间51min、最佳料液比为38：1（g/mL）、最佳乙醇浓度为74%;在所选因素范围内提取影响顺序为：提取乙醇浓度>料液比 >提取功率>提取时间。该试验可为臭灵丹草中的异绿原酸B提取工艺进行优化提供参考，也对该中药的二次开发研究提供了实验基础及科学的实验依据。

参考文献：

[1] 王胤骁.云南民间常用药臭灵丹的研究概述[J].云南中医中药       杂志，2019（07）.

[2] 韩永成.金银花药材质量综合评价研究[J].中国优秀硕士学位      论文全文数据库，2014（01）.

[3] 朱雪飞.固态发酵法制备苜蓿肽的工艺及其理化特性研究[J].      中国优秀硕士学士论文全文数据库，2015（05）.

（编辑：赫亮）