王长丽，黄祯雄，王胜秋，吕进，宾晓芸，杨睿睿，唐华英

右江民族医学院，广西 百色 533000

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副粘病毒科、腮腺炎病毒属的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽类致死性传染病，死亡率高、传播速度快，感染后主要症状包括呼吸窘迫、腹泻、黏膜出血、循环障碍和中枢神经系统损伤，甚至突发死亡[1-2]，对我国养鸡业造成巨大的经济损失[3]。目前，传统NDV疫苗免疫最为常用，虽相对制造成本低廉，但存在保护率低、免疫周期短、接种次数多、剂量大等缺点[4]。NDV疫苗研究进展较快，从传统灭活疫苗到亚单位疫苗、DNA疫苗、重组疫苗。重组杆状载体疫苗相对免疫周期长、保护效价高，是目前预防ND普遍采用的疫苗手段。重组疫苗的临床应用研究较少，通过添加佐剂增强免疫效果是一种主要的预防途径。Gaston[5]首次提出免疫佐剂是一种用于提高疫苗中抗原免疫原性的辅助物质，能够增强疫苗免疫原性和保护性。近年来，免疫刺激的DNA序列CpG ODN备受关注。CpG ODN（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs）是含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸，常作为活疫苗佐剂，可以激活非特异免疫系统的细胞，进而刺激和调节获得性免疫应答[6-7]，广泛应用于禽类多种疫苗研究。根据结构和免疫活力的不同，可将CpG ODN分为A、B、C和P型[8]。其中，B型的作用效果已在临床实验中得到验证[9-10]，能刺激B细胞增殖、NK细胞活化或分泌细胞因子分化。P型CpG ODN是一类新型佐剂，含有2个回文序列，它们刺激细胞产生IFN-α的水平较C型CpG ODN高，具有广阔的应用前景[11]。近年来，重组疫苗在Th1或Th2型免疫应答方面具有局限性黏膜屏障是阻碍疫苗研究的的关键因素，尤其是B、P型CpG ODN。有关联合重组疫苗使用的免疫效果研究较少，其是否具有增强重组疫苗免疫效果的机制尚不明晰。本研究以前期遗传修饰改造的杆状病毒为载体，将NDV关键保护性抗原基因F转移至基因组中构建鸡新城疫重组杆状病毒疫苗BV-BXY-F，以人工合成型CpG ODN B、CpG ODN P为免疫增强剂，以鼻腔免疫方式进行鸡体免疫，通过免疫水平检测免疫过程中2种类型CpG ODN对增强鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫增强效应。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF鸡、9～11日龄发育良好的鸡胚购自广州兽药研究所；BV-BXY-F P3代鸡新城疫重组杆状载体病毒疫苗由右江民族医学院科学实验中心自行制备；鸡胚成纤维细胞由实验中心冻存；NDV F48E9原始毒株由本实验中心保存；DMEM培养液、新生牛血清购自Hyclone公司。

CpG ODN B（根据Ren等[12]的研究参考CpG ODN 1826序列，5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'）、CpG ODN P（根据 Yang等[13]的研究参考CpG ODN 21798序列，5'-TCGTCGACGATCGGC GCGCGCCG-3'）、non CpG ODN B（5'-TGGATCA GCTTGGTCAGCTT-3'）、non CpG ODN P（5'-TG CTGCAGCATGCCGCGCGCGGC-3'）均用于鸡体免疫试验。

1.2 鸡胚成纤维细胞的制备

选取9～11日龄发育良好的SPF胚，用灭菌镊子敲开室部位，无菌取出鸡胚，放入灭菌平皿中，去掉头、尾、内脏和四肢，保留躯干部分，将肌肉组织用PBS冲洗2～3次，剪成细小泥状放入10 mL离心管中，并向离心管内加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化20 min，期间10 min轻摇1次，用3 mL、10%DMEM终止消化，采用6层纱布过滤细胞，滤液经800 r/min离心5 min，弃上清；重复1次上述操作；计数，用DMEM培养液将细胞沉淀重新悬浮至1.0×106/mL，分装至培养瓶（5 mL/瓶），于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 TCID50的测定及免疫-攻毒试验

测定半数组织培养感染剂量（TCID50）。参照1.2制备鸡胚成纤维细胞（1.0×106/mL），并接种于96孔板（100 μL/孔），37℃、5% CO2培养箱中培养24～36 h至长满单层细胞；用PBS将NDV F48E9病毒液进行梯度稀释，将每个梯度的病毒稀释液重复3个，以100 μL接种于铺满单层细胞的96孔板中，不接种病毒作为对照，F48E9病毒吸附CEF细胞1 h（37℃、5% CO2）后吸去病毒液，添加200 μL含10%血清的新鲜DMEM培养液培养，每隔12 h观察一次至CEF细胞明显病变；记录每个稀释度的病毒感染的CEF细胞出现细胞病变效应（CPE）的孔数，计算病毒TCID50。

免疫-攻毒试验。选取14日龄SPF鸡随机分为6个试验组（20只/组，雌雄各半）进行免疫滴鼻试验，A～F组依次为BV-BXY-F+CpG ODN B组、BV-BXY-F+CpG ODN P组、BV-BXY-F+non CpG ODN B组、BV-BXY-F+non CpG ODN P组、BV-BXY-F单独免疫组、PBS对照组。14、28 d进行首免和二次免疫，每只200 μL BV-BXY-F+2 μg CpG ODN混合后滴鼻免疫，采用NDV F48E9病毒株对各组鸡只进行滴鼻攻毒（42日龄），攻毒剂量104EID50/只，攻毒后观察各组鸡体免疫指标变化，直至饲养至10周，统计临床保护率。

1.4 中和抗体效价检测

通过免疫鸡血清中和抗体效价检测试验考察6组免疫鸡血清抗体对NDV F48E9病毒的中和能力，进而评定加入CpG ODN后对鸡体体液的免疫效果。所有免疫组于14、28、42、56和70日龄随机翅静脉采血6只，每只取样500～1000 μL，室温静置，离心分离血清于-20℃保藏；将制备好的鸡胚成纤维细胞接种于96孔板，37℃、5% CO2培养24～36 h至细胞长满单层；用PBS将DNV F48F9病毒株稀释至100 TCID50备用；待测血清融化后56℃水浴30 min，用PBS稀释血清样品 70 μL/孔；取 70 μL 病毒稀释液加至每个稀释度血清样品中，37℃、5% CO2中和反应1 h；吸去96孔板中的DMEM培养液，PBS洗涤2次，将20～30 μL病毒血清中和溶液加入CEF细胞中，每个中和溶液设置3个平行孔，同时设定纯血清和100 TCID50的病毒液为对照组，吸附反应l h；吸去中和液，加DMEM完全培养液，37℃、5% CO2培养96 h，每隔12 h观察、记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算每组血清样品的中和保护价（protective dose，PD50），计算每组血清 PD50的几何平均数，即为该日龄鸡血清的中和抗体几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）。用ELISA检测试剂盒分别检测IgG、IgA、sIgA（分泌型IgA）抗体，评价6组鸡血清抗体NDV体液免疫和黏膜免疫水平。

1.5 淋巴细胞增殖试验

利用刀豆蛋白A（ConA）或病毒的特异性抗原刺激，提取鸡外周血T淋巴细胞，引起增殖效应，根据试验组T淋巴细胞的免疫刺激指数（stimulation index，SI）评估不同刺激组的细胞免疫效果。每组选取3只鸡在首免、二免后的1周（21日龄和35日龄），攻毒后1、2周（49日龄和56日龄）翅静脉采血2 mL，分装于10 mL EP管中，等体积稀释混匀，将稀释血液沿管壁缓慢加入鸡淋巴细胞分离液上（稀释血液与分离液柱高比为3∶2～2∶1），2000 r/min离心20 min，试管中的液体可以分为4层，用1 mL注射器缓慢吸取离心管中间的白色细胞层，将其放入新的10 mL EP管中，加入D-Hank's液重复洗涤2次，1500 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL RPMI1640重悬淋巴细胞（1.0×107/mL）；按照G3580试剂盒说明，加入各试验组的淋巴细胞，每孔 50 μL（5.0×105/孔），共设NDV刺激孔（含50 μL NDV的细胞悬液）、ConA刺激孔（阳性对照，含5 μg/mL ConA的细胞悬液）及相应对照孔（含50 μL RPMI1640培养基）3组，重复 3个，37℃、5% CO2培养 48 h，每孔加入10 μL CellTiter 96 Aqueous One Solution 试剂，37℃恒温孵育4 h，酶标仪检测D490nm，取3个平行孔的平均值，计算刺激指数。SI=试验组D490nm平均值/相应对照组D490nm平均值。

1.6 细胞因子检测

不同试验组分别在 14、28、42、56及 70日龄随机翅静脉采血6只，每只0.5～1 mL，离心分离血清，用细胞因子ELISA试剂盒测定鸡血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和CD4+T细胞、CD8+T细胞的浓度。

1.7 实验数据的统计学分析

所有数据用Origin8.0和Excel软件进行统计学分析，数据均以x±s表示，均数间的比较采用差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 免疫鸡攻毒存活率和临床症状

结果得到TCID50=10-4.5/100 μL，首免和二免后鸡只表现正常，但攻毒2～7 d后均出现不同程度的发病，主要表现为精神低靡、食欲不振、呼吸困难、饮水增多、排便异常，发病后期部分鸡只出现卧地不起、转脖症状，甚至死亡。免疫鸡攻毒结果显示（图1），BV-BXY-F+CpG ODN B联合免疫组（A组）存活率为100%，较BV-BXY-F+CpG ODN P组（B组）、BV-BXY-F单独免疫组（E组）分别提高了31.43%和46.73%。结果表明，免疫佐剂CpG ODN B不仅能够增强BV-BXY-F疫苗对鸡的保护率，且效率明显优于其他组。

2.2 免疫鸡外周血T淋巴细胞增殖情况

图1 6组免疫鸡只生存情况分析

图2 鸡体免疫后淋巴细胞增殖情况

如图2所示，试验组（A和B组）和对照组（E和F组）的T淋巴细胞受NDV和ConA刺激后均出现增殖反应，随着天数的增加，各组鸡的免疫刺激指数SI出现先升高后降低趋势，49 d试验组SI值达到最大分别为 4.52±0.07、4.26±0.09，与对照组（3.01±0.17、0.67±0.05）相比差异极显著（P＜0.01），且A组免疫鸡淋巴细胞的SI值与B组相比差异显著（P＜0.05），说明添加CpG ODN B对鸡体刺激可以产生较强的黏膜免疫应答反应，效果优于其他试验组。

2.3 中和抗体、sIgA、IgG和IgA的测定

如图3所示，A～E组免疫前（14日龄）中和抗体效价和sIgA含量均较低，但在首免和二免后中和抗体效价、sIgA水平均开始上升后下降，分别在42和56 d时达到最大，而PBS对照组抗体始终维持较低水平无明显变化。42 d时，A、B组免疫鸡血液中和抗体效价分别为1634.56±2.65和1237.52±2.21，与E组（863.08±3.24）相比差异极显著（P＜0.01）；56 d时，A、B组免疫鸡鼻腔中 sIgA抗体水平分别为435.06±2.01和401.19±3.50 ng/L，与 E组（382.60±2.69 ng/L）相比差异显著（P＜0.05）。同时，A组免疫鸡血清中和抗体效价和免疫鸡鼻腔中sIgA抗体水平分别较B组提高了32.08%和8.44%，差异显著（P＜0.05）。结果说明CpG ODN对重组疫苗BV-BXY-F起到了免疫协同作用，能刺激鸡体产生体液免疫应答，添加CpG ODN B能够对BV-BXY-F起到较强的免疫协同作用，刺激鸡体产生较强的黏膜免疫应答，效果优于其他组，检测结果与攻毒保护结果基本吻合。

如图4所示，各试验组首免后免疫鸡血清中IgG和IgA抗体水平呈先升高后降低，56 d和42 d时各组IgG和IgA值达到最大，而PBS对照组免疫鸡血清中IgG和IgA抗体水平始终较低。A组免疫鸡血清中IgG和IgA抗体含量较E组分别提高了10.4%和21.3%，且差异显著（P＜0.05），B组的IgG和IgA抗体水平则低于E组。与此同时，A组免疫鸡血清中IgG和IgA抗体含量较B组分别提高了 13.56%和 23.71%（P＜0.05），表明添加 CpG ODN B可以协同重组疫苗，更好地刺激鸡体产生更强的黏膜免疫应答和体液免疫应答反应。

2.4 细胞因子免疫指标分析

A组IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4+T细胞和CD8+T细胞含量分别为 613.34±2.87（56 d）、798.66±3.47（42 d）、963.48±5.55（42 d）、132.46±0.37（56 d）、192.32±0.25（42 d），与 B 组相比差异显著（P＜0.05），与E组相比差异极显著（P＜0.01）。说明添加CpG ODN B对BV-BXY-F起到了免疫协同作用，能刺激机体产生细胞免疫应答，诱导鸡体产生较强的黏膜免疫应答。

70 d时，A组细胞因子仍维持较高水平，IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4+T细胞和CD8+T细胞含量分别为 126.89±1.59、162.24±3.54、155.26±2.93、46.29±0.22、46.64±0.80，与B组相比差异显著（P＜0.05），与E组相比差异显著（P＜0.05）。说明添加CpG ODN B，在免疫后期能协助重组疫苗刺激机体产生细胞免疫应答，诱导鸡体黏膜免疫应答。综上所述，添加CpG ODN B对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗有增强效应。

图3 鸡体免疫组诱导NDV中和抗体效价和鸡鼻腔中sIgA抗体水平

图4 鸡血清中IgG和IgA抗体水平

3 讨论

新城疫是禽类致死性传染病，对我国养禽业造成巨大的经济损失。添加CpG ODN对增强鸡新城疫重组杆状病毒载体疫苗是临床上有效的预防手段之一。CpG ODN可激活哺乳动物、禽类及鱼类的免疫系统，通过天然免疫系统增强机体对外界病原的抵抗力[14]。在鸡体内，TLR配体作为佐剂可以增强对病毒、细菌、寄生虫感染的免疫防护，获得了理想的结果[15]。B型CpG ODN 2007与H9N2禽流感病毒灭活疫苗联合肌肉注射鸡群，能够更加有效地刺激产生中和抗体免疫应答，中和抗体水平显著高于以角鲨烯基为佐剂的疫苗[16]；CpG ODN 2007与NDV灭活疫苗联合鼻内给药免疫鸡群，提高了血清IgG和sIgA的表达水平，可以诱导T细胞的分化，保护鸡群免受NDV强毒株的致死性攻击[17]；CpG ODN 2007可以通过上皮树突状细胞的吸收，帮助H9N2禽流感病毒穿过鼻黏膜上皮细胞，这是最佳固有免疫应答的一个全新机制[6]。上述研究表明CpG ODN可以有效激活鸡体的黏膜和全身免疫应答，为进一步发展滴鼻的禽类病毒疫苗提供了全新前景。随着研究的深入，发现通过改变CpG ODN的序列和结构来改变其类型和性质，可以优化其免疫增强效果，但不同类型CpG ODN对于不同类型疫苗黏膜免疫效果的影响不同。

本研究以人工合成的2种类型的CpG ODN为免疫佐剂，与鸡新城疫重组杆状病毒载体疫苗BV-BXY-F混合后在鸡体内进行滴鼻免疫及攻毒保护实验。结果表明，CpG ODN B联合免疫组的鸡只保护率达100%，而CpG ODN P联合免疫组的存活率为68.57%，表明不同类型CpG ODN的免疫协同能力确有不同。He[18]等在评价各类合成CpG ODN诱导火鸡先天免疫应答能力时同样发现，不同CpG基序和不同序列结构对于CpG ODN的免疫刺激活性有很大的影响。该团队通过测量火鸡外周血单个核细胞中的NO产量来评价CpG ODN诱导火鸡先天免疫应答能力，结果发现能够诱导NO大量产生的CpG ODN是人特异性CpG ODN M362，随后是CpG ODN 2006（人）和CpG ODN 1826（小鼠）。可见，在众多类型的CpG ODN中，CpG ODN 1826具有较强的免疫刺激作用，故本研究中合成的CpG ODN序列参照文献中的CpG ODN 1826序列进行设计，结果表明CpG ODN B对鸡新城疫杆状病毒疫苗的免疫增强效果较好。另外，添加CpG ODN B联合免疫组的中和抗体水平也明显高于添加CpG ODN P组，此结果与Wang[19]等分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌和B类CpG ODN作为免疫佐剂与H5N1灭活油乳剂疫苗联用进行鸡体免疫结果类似。可见，添加CpG ODN B对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗有较强的免疫协同作用。本研究中联合免疫组BV-BXY-F+CpG ODN B的免疫鸡血清IgG和IgA抗体水平较BV-BXYF+CpG ODN P组分别提高13.56%和23.71%。Gomis[20]等将CpG ODN注射至鸡的感染部位时发现注射部位的IgG抗体水平明显升高，表明CpG ODN可诱导鸡体产生不同水平的黏膜免疫应答，进而刺激不同水平的体液免疫应答。细胞免疫应答水平方面，CpG ODN B联合免疫组免疫鸡血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量均明显高于CpG ODN P联合免疫组，此结果与Chrzastek[21]等一致，免疫鸡外周血淋巴增殖试验亦得到相似结果。表明不同类型的CpG ODN可诱导鸡体产生不同水平的细胞免疫应答，其中CpG ODN B的免疫增强效果最为显著。

此外，CpG ODN B联合免疫组的sIgA水平远高于CpG ODN P联合免疫组，且差异显著，此结果与Iho[7]等一致。可见，CpG ODN确实可作为黏膜佐剂进行机体免疫，协助各类疫苗提高其免疫效果，且CpG ODN B和CpG ODN P具有不同的免疫协同作用。从结果来看，当CpG ODN B刺激鸡体黏膜组织时可产生较高水平的黏膜免疫应答，进而诱导鸡体产生较高水平的全身系统性免疫应答，以全面提高疫苗的免疫保护效果，添加CpG ODN B对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的增强效果较好。