茹克亚木·色麦提，迪拉拉·吐尔逊

新疆喀什地区第一人民医院 a.呼吸与危重症医学一科；b.呼吸与危重症医学二科；新疆 喀什844000

流感病毒性肺炎是一种由病毒感染引起的比较严重的间质性肺炎，具有发病率高、危重、死亡率高等特点。炎症反应是机体重要的免疫防御机制，有助于机体抵抗病原微生物感染。研究表明，病毒侵入机体后，若不能被及时清除，流感病毒性肺炎患者会产生过度的炎症免疫应答，导致肺组织的实质性损伤[1]。因此，探究流感病毒性肺炎患者炎症反应的发生机制已成为目前研究的热点和难点。microRNA（miRNA）是一类非编码内源性小RNA，它们通过与靶基因的3'端非编码区结合，下调靶基因的表达水平，对生物体中许多基本生命过程起重要的调控作用。miR-124-3p作为一种炎症相关miRNA，在许多炎症疾病的生理和病理过程中发挥重要作用[2-3]，但其是否参与调控流感病毒性肺炎的炎症反应未见报道。本研究初步探讨miR-124-3p在流感病毒性肺炎中的表达及其对炎症反应的影响，并初步研究其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

昆明小鼠由安徽医科大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重18～20 g；流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株（FM1）由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。参考万巧凤[4]等的方法，在广州海关技术中心生物安全检测国家重点实验室建立病毒性肺炎小鼠模型，肺组织出现组织充血和水肿为模型建立成功。

293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；TLR4、核转录因子（NF）κB p65、GAPDH、核纤层蛋白A（Lamin A）抗体及HRP标记二抗，白细胞介素（IL）1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）α的ELISA试剂购自艾博抗（上海）贸易有限公司；蛋白双染marker、显影液、脱脂奶粉、一步法反转录荧光定量试剂盒、TRIzol试剂购自上海生工生物科技有限公司；miR-124-3p agomir及阴性对照购自Promega公司；核蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 注射及分组

取30只建模成功的小鼠分为3组，每组各10只。模型组，尾部注射PBS缓冲液；agomir NC对照组，尾部注射agomir NC（无义序列）；miR-124-3p agomir组，尾部注射miR-124-3p agomir。连续注射3 d，注射剂量参考文献[5]，第4 d摘眼球取血并取出肺组织称量备用。另取10只同龄昆明小鼠作为正常组。

1.3 RT-qPCR检测miR-124-3p的表达

TRIzol法抽提10只病毒性肺炎小鼠和10只正常小鼠肺组织的RNA，分别采用一步法反转录荧光定量试剂盒检测miR-124-3p的表达。miR-124-3p上游引物为5'-TGAGGGCCCCTCTGCGTG TTCA-3'，下游引物为5'-GGAGGCGCCTCTCTTG GCATTC-3'。以U6为内参，U6上游引物为5'-G CTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3。

1.4 ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平

将采集的血液以3000 r/min离心5 min，收集血浆，采用ELISA试剂盒检测血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

1.5 HE染色

各组肺组织按1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大小取材，用10%甲醛固定，石蜡包埋后HE染色进行病理学检查。

1.6 核质分离

各组肺组织中加入 200～500 μL PBS，用匀浆器冰上匀浆制成细胞悬液，500 r/min离心2～3 min收集细胞，吸尽上清，收集沉淀，加入200 μL浆蛋白，用移液器吹打或高速涡旋15 s，冰浴10 min，剧烈涡旋 10 s，4℃、12 000～16 000 r/min离心10 min，上清即为抽提得到的细胞核蛋白。

1.7 Western印迹检测蛋白水平

各组肺组织中分别加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃、13 000 r/min离心20 min，上清即为抽提得到的细胞蛋白。采用BCA试剂盒测定细胞蛋白或细胞核蛋白含量。取35 μg蛋白液进行SDS-PAGE，转膜，用封闭液（2%BSA）封闭，分别加入一抗后4℃过夜（以GAPDH和Lamin A抗体为参照），洗涤后，再加入二抗室温孵育1 h。ECL曝光成像，最后采用Alpha Imager HP凝胶成像系统分析结果。

1.8 数据统计

采用SPSS 21.0软件分析数据。计量资料用x±s表示；符合正态分布的计量资料，多组比较采用单因素方差分析，2组比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 病毒性肺炎小鼠肺组织中miR-124-3p的表达情况

RT-qPCR检测结果显示，miR-124-3p在模型组、正常组、miR-124-3p agomir注射组、agomir NC组的相对表达量依次为8.12±0.14、26.64±0.24、14.99±0.39、8.11±0.10，4组组织中的表达差异有统计学意义（F=12 768.00，P＜0.001）；病毒性肺炎小鼠肺组织中miR-124-3p的相对表达量与正常小鼠肺组织相比，明显降低（q=239.40，P＜0.001）；miR-124-3p agomir注射组鼠肺组织中miR-124-3p的表达量明显高于agomir NC组（q=88.95，P＜0.001）。

2.2 注射miR-124-3p抑制小鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达

各组血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达差异有统计学意义（FIL-1β=80.49，P＜0.001；FIL-6=1046.00，P＜0.001；FTNF-α=7500.00，P＜0.001）。miR-124-3p agomir注射组血浆中 IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显低于agomir NC组（qIL-1β=122.70，P＜0.001；qIL-6=47.47，P＜0.001；qTNF-α=136.00，P＜0.001）和模型组（qIL-1β=126.60，P＜0.001；qIL-6=45.64，P＜0.001；qTNF-α=132.80，P＜0.001），而 miR-124-3p agomir注射组血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显高于正常 组（qL-1β=25.30，P＜0.001；qIL-6=16.43，P＜0.001；qTNF-α=28.46，P＜0.001）。见表1。

表1 miR-124-3p对小鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响

图1 miR-124-3p对肺组织病理形态的影响（HE×200）

2.3 注射miR-124-3p减轻小鼠肺组织的炎症

HE染色切片（图1）显示，正常组小鼠的肺组织肺泡和支气管结构清晰完整，支气管周围肺间质内未见炎症细胞浸润和渗出；模型组和agomir NC组小鼠肺组织肺泡间隔增厚，间质内血管明显扩张，肺泡腔内充满浆液性渗出物，支气管周围肺间质内可见大量淋巴细胞、单核细胞浸润；miR-124-3p agomir注射组小鼠肺组织病理改变较轻，只有少量炎细胞渗出和浸润。

2.4 注射miR-124-3p抑制小鼠TLR4和NF-κB p65的表达

Western印迹结果表明，各组肺组织TLR4、NF-κB p65和细胞核NF-κB p65的表达差异有统计学意义（FTLR4=372.80，P＜0.001；FNF-κBp65=251.10，P＜0.001；F核NF-κBp65=362.80，P＜0.001）。miR-124-3p agomir注射组小鼠肺组织中TLR4、NF-κB p65和细胞核NF-κB p65的表达明显低于模型组（qTLR4=38.02，P＜0.001；qNF-κBp65=33.95，P＜0.001；q核NF-κBp65=38.41，P＜0.001）和agomir NC组（qTLR4=37.97，P＜0.001；qNF-κBp65=33.09，P＜0.001；q核NF-κBp65=39.55，P＜0.001），而 miR-124-3p agomir注射组小鼠肺组织中TLR4、NF-κB p65和细胞核NF-κB p65的表达明显高于正常组（qTLR4=10.91，P＜0.001；qNF-κBp65=20.09，P＜0.001；q核NF-κBp65=16.00，P＜0.001）。见图2、表2。

3 讨论

miRNA作为小RNA中的一种，与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、人类遗传疾病和神经系统疾病的发生发展密切相关。Huang[6]等研究表明miR-127-3p、miR-493-5p和miR-409-3p在流感病毒性肺炎患者血浆中的表达存在差异，通过生物信息学预测miR-127-3p、miR-493-5p和miR-409-3p的靶基因，其对应的大多数靶基因都参与了MAPK/ERK信号通路的活化。Liu[7]等研究发现机体病毒感染后会上调miRNA-200c-3p的表达，通过负向调控血管紧张素转换酶2（ACE2）加重肺损伤。因此，miRNA在流感病毒性肺炎发病机理中可能起关键作用。

图2 miR-124-3p对肺组织中TLR4、NF-κB p65和细胞核中NF-κB p65表达的影响

表2 miR-124-3p对肺组织中TLR4、NF-κB p65和细胞核中NF-κB p65表达的影响（倍数）

miR-124是一种在免疫细胞和器官如骨髓、淋巴结、胸腺和外周血单核细胞中高表达的保守性miRNA，以miR-124-3p及miR-124-5p两种形式存在，但以miR-124-3p为主。miR-124-3p在神经系统内被首次发现，被证实能够缓解阿尔茨海默病等多种类型的神经退行性疾病中的神经元死亡；此外还被证实能够抑制甲状腺癌等多种肿瘤的增殖与迁移，发挥抑癌作用[8-11]。值得注意的是，Zhang[3]等研究指出miR-124-3p通过靶向TRAF6可抑制肾小球系膜细胞的生长和炎症反应。Ma[12]等发现miR-124-3p直接抑制Toll样受体 6（TLR6）、髓样分化因子 88（MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、TNF-α等TLR信号通路相关基因的表达，减轻肺泡巨噬细胞的炎症反应。以上研究提示miR-124-3p是一个抗炎因子。本研究发现miR-124-3p在流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株（FM1）感染所致病毒性肺炎小鼠肺组织中表达下调。由此，我们推测miR-124-3p可能在调控流感病毒性肺炎的炎症反应中发挥作用。基于此结果，本研究将miR-124-3p agomir注射到病毒性肺炎小鼠体内，发现血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α明显降低，肺组织炎细胞渗出和浸润减轻。进一步证实miR-124-3p在流感病毒性肺炎中发挥抗炎作用。

TLR4是先天免疫受体，参与机体免疫调控和炎症反应。流感病毒感染肺泡巨噬细胞后，激活TLR4信号通路，引发NF-κB活化和促炎症因子产生，从而损伤肺组织[13-14]。通过生物信息学网站预测到miR-124-3p可以与TLR4的3'非翻译区互补结合，且Su[15]等应用双萤光素酶实验验证了miR-124-3p对TLR4有靶向调控作用。此外，在病毒性肺炎小鼠体内注入miR-124-3p agomir降低了TLR4和NF-κB p65的表达，并且减轻了炎症反应。结合上文我们可以推测miR-124-3p通过靶向TLR4阻断NF-κB通路抑制流感病毒性肺炎的炎症反应，与Li[16]等的研究结果相同，他们发现miR-124-3p通过抑制TLR4/NF-κB/CCL2减轻高氧诱导的肺上皮细胞的炎症反应。

本研究初步探究了miR-124-3p靶向抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻流感病毒性肺炎的炎症反应，但值得注意的是，miRNA对靶基因的调控机制比较复杂，一个miRNA可能调控若干靶基因。因此，需要进一步研究miR-124-3p在流感病毒性肺炎中的具体机制。