廖夫生，韦国兵，熊 魏

(江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004)

栀子是我国首批药食两用中药材，目前主要产于江西、湖南、四川等地，是江西道地药材之一。栀子具有抗炎镇痛、保肝利胆等作用，同时对神经系统和心脑血管疾病也有一定治疗作用。栀子中主要含有栀子苷、西红花素、栀子酸等成分，现代药理研究表明，栀子中主要药理成分为栀子苷。2020版中国药典中，采用HPLC法测定了栀子中栀子苷的含量[1]。

但在测量过程中，往往存在各种因素使得测定结果不准确，因此分析测量不确定度是评价测定方法的重要指标，也决定了测量结果的实用价值，不确定度越小，使用价值越大[2-4]。本文以栀子苷含量测定为例，对HPLC法含量测定不确定度评价进行分析，找出此法不确定度产生的主要因素，建立HPLC外标法不确定度的通用模型，对HPLC法不确定度的评价有一定意义。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

1260Agilent HPLC仪；色谱柱Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm)；AB104-N分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 材 料

栀子、栀子苷对照品(批号：1107499-200714，>98.0%)，中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱: Eclipse XDB-C18(250 mm×416 mm，5 μm)； 流动相：乙腈-水(15:85)，流速：1.0 mL·min-1；检测波长：238 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液制备

精密称取的对照品栀子苷16.24 mg，置25 mL容量瓶中，加15 mL甲醇超声溶解后，稀释至刻度，摇匀，即得栀子苷对照品储备液。精密量取栀子对照品储备液2 mL至25 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。制成浓度51.968 μg/mL的栀子苷对照品溶液，在上述色谱条件下进样测定，测定5次，峰面积分别为：599.1，602.7，592.3，605.4，596.0。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取0.5 g栀子粉末，精密加入25 mL无水甲醇，称重，超声提取30 min，补重，过滤，精密量取2 mL续滤液至25 mL的容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，供试品溶液。分别测定5次，峰面积分别为：543.6，550.1，553.4，548.9，592.6。

2.4 样品测定

量取对照品溶液和供试品溶液20 μL，分别进样，测定，按外标一点法进行计算，结果栀子中栀子苷的含量为2.98%。

3 不确定度分析[5-6]

3.1 数学模型

3.2 分析不确定度来源

依据数学模型可知，供试品含量测定结果的误差主要来源于mi、As、Vs、Vi、ms、Ai六个分量。进一步分析可知实验整个过程的误差主要来源于2个方面：峰面积测定的不确定度和浓度的不确定度。但在分析每一个不确定度时应该考虑其每一个影响因素。

4 不确定度分量的计算

4.1 对照品纯度的不确定度u(pi)

4.2 质量类不确定度(mi，ms)

4.2.1 对照品称质量的相对不确定度u(ms)

主要有2个来源，包括电子天平称量值的不确定度u(ms1)和电子天平重复性代入的不确定度u(ms2)：1级电子天平的允许误差为±0.1 mg，按正态分布计算u(mi1)=0.1/3=0.033 mg：1级电子天平允许的RSD为0.05 mg。由于对照品栀子苷取样量为16.24 mg，则相对标准不确定度为:

4.2.2 样品质量的不确定度u(mi)

同样来源于电子天平称量值的不确定度u(mi1)和称量天平重复性代入的不确定度u(mi2)，栀子取样量为0.4997 g，则相对标准不确定度为：

因此质量类引入的不确定度：

4.3 体积类不确定度(Vs、Vi)

4.3.1 配制对照品溶液时引入的体积不确定度u(Vs)

同样可知5 mL移液管u(Vs2)：

u(Vs22)=0.008 mL

因此，对照品合成标准相对不确定度为：

4.3.2 样品稀释时引入的体积不确定度

样品稀释时使用了50 mL量瓶、5 mL移液管，采用4.3.1方法分别对这些玻璃仪器的不确定度u(Vi)进行分析，50 mL量瓶的不确定为：

5 mL移液管u(Vi2)的不确定度为:

u(Vi22)=0.016 mL

因此，样品稀释引起的相对不确定度为：

4.4 峰面积类不确定度(AS，Ai)

4.4.1 对照品的峰面积不确定度u(As)

4.4.2 样品测得的峰面积的相对不确定度u(Ai)

因此由峰面积类引入的不确定度为：

4.5 不确定度的合成与评价

4.5.1 合成标准不确定度

4.5.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，则栀子苷的扩展不确定度

Ur(S)=2.98%×0.0058×2=0.035%

5 结 论

采用HPLC对栀子苷含量进行测定时，对测定结果影响因素很多，难以一一评估，对已评估的几个主要影响不确定度因素中，对照品纯度为0.577%，质量类为0.380%，体积类为0.4248%，峰面积类为0.999%，峰面积引入的不确定度最大。而峰面积引入的不确定主要和仪器的精密度有关，仪器的精密度越好，重复性越高，不确定度越小，结果越准确。因此，在测定过程中。增加进样次数、采用自动进样，可减少进样误差，提高进样的精密度和重复性。