伍 燕，张倩倩，张 娟，易君明

(兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州 兴义 562400)

香樟(CinnamomumcamphoraL.Presl)为樟科(Lauraceae)樟属乔木，又名樟木、乌樟、番樟、芳樟等，在我国主要分布于长江流域及南方[1]。香樟作为原料可提取樟脑、樟油，广泛应用于化工、医药卫生及香精香料工业[2-3]，传统中医认为香樟具有温中止痛、解毒消肿等疗效，现代药理研究表明香樟具有抑菌、抗氧化、趋避、拒食和杀虫等活性[4-5]，香樟在南方是常绿乔木，树形挺拔秀美且具有一定程度的吸收净化尾气、滞纳重金属及滞尘能力，因而在城市绿化中应用较广[6-7]。

香樟全株散发特有的香樟味，主要挥发油成分有芳樟醇、1,8-桉叶油素、樟脑、异-橙花叔醇和龙脑等天然成分，但不同地域及气候条件下生长的香樟挥发油成分不相同，如张国防等发现福建省的樟树(Cinnamomumcamphora) 存在芳樟型、脑樟型、桉樟型、黄樟型和杂樟型等5种化学类型[8]，也有的研究者依据精油中主要成分把香樟分为油樟、脑樟、芳樟、异樟和龙脑樟[9]。贵州兴义地区气候温润多雨，香樟生长繁茂，对其挥发油的成分研究还未见报道，本研究以贵州兴义产香樟为研究对象，水蒸气蒸馏法提取精油，对其可挥发性成分进行GCMS分析，采用对倍稀释法对常见病原菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、白色念珠菌原菌、热带假丝酵母菌、苹果斑点落叶病原菌、油菜黑斑病和核桃膏药病原菌进行了抑菌实验；为了解香樟精油的抗氧化活性，检测了不同浓度香樟精油对DPPH、ABTs和OH自由基的清除效果，以期为兴义香樟的开发利用和树种选育奠定理论基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂

试验材料：香樟(Cinnamomumcamphora)新鲜植株，8月份采集于兴义民族师范学院校园内。

实验菌株：大肠杆菌(Escherichiacoil，ATCC-8739)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，ATCC-6633)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC-25923)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，ATCC-4532)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC-10231)、热带假丝酵母菌(Candidatropicalis，ATCC-13803)。苹果斑点落叶病原菌(Alternariamali)、油菜黑斑病原菌(Alternariabrassicae)和菌核桃膏药病原菌(Septobasidiumbogoriense)，本实验室分离保存。

药品和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，青岛科技工业园海博生物技术有限公司；2,2’- 联氨 -双(3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二胺盐、1,1-二苯基-2-苦肼基，麦克林试剂公司；水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇和二甲基亚砜、丙酮酸，二甲基亚砜、氯化钠、无水乙醇、硫酸、氯化钡等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器和设备

SW-CJ-1F超净工作台，上海博讯实业有限公司；YXQ-SL-100G高压蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；LRH-250生化恒温培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；DHG-9246A精宏电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；FA2004电子分析天平 0.1 mg～200 g，常州科源电子仪器有限公司；BILON-HX-200冷却水循环机，上海比朗仪器制造有限公司；7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.3 方 法

1.3.1 水蒸气蒸馏法提取香樟精油

摘取新鲜的香樟叶片及果实200 g放入2000 mL圆底烧瓶中，加入1000 mL蒸馏水，用电热套加热，水蒸气蒸馏法提取3～4 h至无挥发油产生，收集精油用无水Na2SO4除水干燥，4 ℃保存备用[10]。

1.3.2 香樟精油可挥发成分分析

色谱柱：HP-5弹性石英毛细血管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，载气为高纯氦气，流速为1.45 mL/min，分流比50:1进样量1 μL，进样口温度280 ℃，程序升温为柱温80 ℃，3 ℃/min的速率升至240 ℃。

质谱条件[11]：电子轰击(EI)能量70 eV，离子源温度220 ℃，接口温度250 ℃溶剂，延迟2 min，全扫描，质量扫描范围为50～400 m/z。

1.3.3 香樟精油抑菌活性的测定

精油样品母液的配制：在分析天平上称量0.5 g精油，加入到1.5 mL的EP管中用DMSO定容到1 mL，取20 μL溶于0.98 mL的LA或PDA中(稀释50倍)，终浓度为10000 μg/mL记作A液；配2%DMSO的LA或PDA 10 mL培养基，记作B液；用接种环挑取微量各供试菌株到5 mL无菌水中悬浮，与浊度为1的麦氏比浊液进行比对，取比对后的菌液10 μL加入到9.99 mL的LA或PDA中，记为C液，此时菌液浓度为1×105cfu。

在96孔板上采用微量对倍稀释法测定香樟精油的最低抑菌浓度(MIC)，每个菌株一个96孔板，A1～A11孔为实验组，A12孔为培养基空白对照组，重复三列。细菌用牛肉膏蛋白胨培养基(LA)，真菌用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，第1孔和第2孔各加100 μL的精油A液，第2～12孔各加100 μL培养基B液，依次对2～11孔做梯度稀释；稀释完后分别在1～12孔中加入100 μL的菌液(C液)，使得第1～11孔香樟精油的浓度为：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.062、19.531、9.765和4.882 μg/mL。加完菌液的96孔板置于30 ℃培养箱中培养24 h，比较检验组与空白对照组的混浊度的差异，无可见细菌生长、液体相对澄清且无沉淀的孔板内所含的精油浓度即为最小抑菌浓度(MIC值)[12]。

1.3.4 香樟精油抗氧化活性的测定

(1)香樟精油工作液配制。称取适量香樟精油，用无水乙醇定容成100 mg/mL母液，依次稀释成80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL不同浓度工作液。

(2)ABTs·清除试验[13]。取96孔板，依次加入不同浓度香樟精油50 μL，再加入150 μL的ABTs工作液，混匀、避光静置6 min后，在734 nm波长处测定吸光度值，记作Ai(样品吸光度值)；取精油不同浓度样液50 μL，以ddH2O代替ABTs溶液，同法测定吸光度值，记作Aj(样品本底吸光度值)；取50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，同法测定吸光度值，记作A0(阴性对照)，每个浓度重复3次。

ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)DPPH·清除试验[14]。取96孔板，依次加入不同浓度香樟精油100 μL，加入0.1 mmol/L DPPH工作液100 μL，混匀、避光静置30 min，在517 nm波长处用酶标仪测定吸光度，记作Ai(样品吸光度值)；另取不同浓度样液100 μL加入无水乙醇100 μL，同法测定吸光度，记为Aj(样品本底吸光度值)；另取无水乙醇 100 μL加入DPPH工作液100 μL，测定吸光度记为A0(阴性对照)。 DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

(4)·OH清除试验[15]。取不同浓度样液100 μL，依次加入9.0 mmol/L水杨酸乙醇溶液100 μL、9.0 mmol/L FeSO4溶液100 μL、8.8 mmol/L H2O2溶液100 μL启动反应，混匀后37 ℃水浴30 min，取200 μL各样液在510 nm波长处测定吸光度，记为Ai(样品吸光度值)；另以ddH2O代替样液，同法测定，记为A0(阴性对照)。

·OH清除率=(A0-Ai)/A0×100%

1.3.5 数据处理

用EXCEL 2010、ORINIG 9.0处理数据。

2 结果与讨论

2.1 香樟精油的主要成分

图1为香樟精油可挥发性成分总离子流程图，各组分质谱碎片在质谱检索标准库NIST 14中进行匹配解析，匹配度达85%以上的有25个成分，占挥发性组分的97.19%，按峰面积归一化法计算各成分的相对质量分数，结果如表1所示。

图1 香樟精油挥发性成分总离子流程图

表1 香樟精油的化学成分 Table 1 Chemical composition ofCinnamomum camphora essential oil

2.2 香樟精油对各供试菌株的抑制活性

香樟精油对不同病原菌的最小抑菌浓度见表2，由表可知，香樟精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、热带假丝酵母的抑制效果较好，最小抑菌浓度MIC值分别为9.77、19.53、156.25和9.77 μg/mL，对大肠杆菌没有抑制活性；对植物病原菌引起的苹果斑点落叶病、油菜黑斑病和核桃膏药病菌有一定的抑制作用，MIC分别为1250、2500和625 μg/mL。

表2 香樟精油对不同病原菌生长的抑制(μg/mL)

1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别表示5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.062、19.531、9.765和4.882 μg/mL。

2.3 香樟精油的抗氧化活性

图2所示，香樟精油对ABTs和DPPH自由基具有良好的清除作用，经各自回归方程计算，EC50值分别为33.09和44.26 mg/mL，对OH自由基的清除作用不明显。

图2 香樟精油对ABTs、DPPH和OH自由基的清除率

3 结 论

水蒸气蒸馏法提取的香樟精油，颜色呈淡黄色，散发浓郁的芳香味。经GC-MS分析，共鉴定出25种物质，主要成分是松油烯(29.69%)、异樟醇(12.36%)、乙酸肉桂酯(9.65%)、柠檬烯(9.41%)、α-松油醇(4.02%)、萜品油烯(3.93%)，这些成分为兴义香樟特有香味的主要来源。如图3所示，本研究中的主要成分都属于单环单萜类，结构上以萜烯和含氧萜烯为主。

图3 香樟主要单萜类型

抑菌实验表明，香樟精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、热带假丝酵母菌的抑制效果较好，对植物病原菌苹果斑点落叶病、油菜黑斑病和核桃膏药病菌有一定的抑制作用，对细菌和真菌的抑制作用与精油中丰富的松油烯、樟醇有关，这类次生代谢物有抑菌驱虫、抗菌消炎的作用，其中具有倍半萜成分的沃伯格醛(warburganal)具有明显的杀菌活性，倍半萜类成分的8,9-二醛基和7,8位不饱和的Drimane骨架化合物，对病原菌具有很强的拒食活性[16-17]。香樟精油的抗氧化活性表现良好，尤其对DPPH和ABTs自由基的清除效果较好，这与精油中丰富的萜类物质有关[18]。香樟精油良好的抑菌活性及抗氧化活性，为深入了解和开发兴义香樟的生物活性及经济价值提供了理论依据。