廖艺钰，惠吕佳，严吉祥，计伟佳，陈夏伟，杨华云

(杭州师范大学钱江学院，浙江 杭州 310018)

随着社会现代化的不断发展，各种污染物大量地进入水体环境，农药作为一种十分常见的污染物，是水域安全评价的重要指标。作为有机氯农药的替代品，有机磷农药在我国使用量非常大。该类农药是一类高效经济的常用杀虫杀螨剂，但其利用率非常低，约在20%左右，剩下的80%则全部进入环境中。经过生物富集与食物链的传递和逐级浓缩、放大等作用，有机磷农药对生物和人类的健康以及环境造成很大的危害。通过河流、大气工业排放等方式，有机磷农药一般最终将汇入海洋，因此海洋成为了有机磷的最终归宿。然而，大多数海洋生物对有机磷农药十分敏感，因此引发大量的鱼、虾、贝等的大量死亡，危及了非靶生物的生存，导致海洋动物数量剧减，甚至灭绝，威胁到海水养殖业的可持续发展[1]。草甘膦对人和土壤生物等均有不同程度的毒性，但目前关于这种除草剂对水生态危害的报道较少，研究斑马鱼对这种除草剂的响应，旨在引起人们关注水生态中除草剂的安全问题，并为其合理施用提供科学依据。本文以斑马鱼作为模式生物，研究有机磷农药对斑马鱼的急性毒性以及慢性毒性的影响，以期得到有机磷农药对斑马鱼的毒性效应，为保障居民身体健康以及环境保护提供理论依据。

1 实 验

1.1 材 料

作为国际标准化组织推荐的实验鱼种，斑马鱼购于杭州某花鸟市场，平均体长1～2.5 cm，体重100～400 mg。草甘膦农药标准品购于国家标准物质中心，实验时需要现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性实验

(1)斑马鱼预先购买放置在实验室内驯养7 d，每24 h喂食一次，实验用水为实验室蒸馏水，目的是排除氯离子的干扰，并同时使用增氧泵，保证溶解氧≥5.0 mg/L，试验用水温度控制在(25±1)℃，试验前两天停止喂食。

(2)经过预实验，确定各实验药物的质量浓度范围(96 h全活质量浓度上限和96 h全致死质量浓度下限)后，在室温条件下，在长宽高为20×17×15(cm)的鱼缸中，按一定的间距设置不同的浓度梯度组，试验共五组，一组空白对照组，采用静态实验法，开展单一有机磷农药对斑马鱼的急性毒性实验。每个浓度梯度放置10尾实验动物，各鱼缸中溶液的体积均为2 L，连续观察受试对象的活动状态，以用镊子触碰鱼头部5 s以上完全无反应作为死亡判断标准，及时取出死亡个体，分别记录24 h，48 h，72 h，96 h的死亡数量，计算一次的总体平均死亡率。

(3)数据处理

采用寇氏法[2]计算斑马鱼的半致死浓度LC50：

LogLC50=Xm-d(∑P-0.5)

安全质量浓度SC按以下公式计算：

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.2.2 慢性毒性实验

(1)斑马鱼的驯养过程和急性毒性实验的驯养过程相同，试验前两天停止喂食，根据急性毒性实验的结果，设置5个不同浓度梯度的实验组，一个空白对照组，每个浓度梯度放置10尾鱼。采用静态实验法，分别于1 d，7 d，14 d后采集样本。

(2)酶的测定

分别在7 d、14 d时，在每缸中取5尾实验动物，在冰块上冰麻后称量其体重，放入匀浆管中，再按照体重49倍加入生理盐水进行匀浆，充分研碎，使组织匀浆化。将配制好的匀浆用离心机1500 r/min进行离心10 min，离心后取上清液放入1 cm光径比色皿，于412 nm处使用分光光度计测量其吸光度，空白管用来调零，测各管的吸光度。同标准乙酰胆碱酯酶溶液对比后并计算酶活。

(3)标准曲线配制

精确量取乙酰胆碱酯酶的标准液，分别制得0、0.2、0.4、0.6、1 ppm的酶溶液，以酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。得到标准曲线为Y = 0.3599x-0.0046，相关系数R2=0.9967。实验以此标准曲线为准。

图1 乙酰胆碱酯酶标准曲线

(4)数据处理

酶活计算公式：

式中：ΔA412为反应前后吸光度的差值；V为反应体系总体积；ε为产物的摩尔吸光系数；T为反应时间；d为比色皿宽。

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼急性毒性实验试验结果

草甘膦对斑马鱼的急性毒性实验结果表明：草甘膦浓度达到2.0 mg/gL以上时，24 h内试验鱼全部死亡；草甘膦的浓度达到3.0 mg/gL时，2 h内个别鱼开始出现侧翻，身体不平衡的现象，8 h后在底部挣扎，严重失衡，12 h内全部死亡。随着时间的推移，各个浓度的鱼都有出现个别死亡。草甘膦对斑马鱼的毒性比较强，斑马鱼刚开始出现急蹿现象，而且伴有集群现象，但很快就消失，稍后鱼群都聚集在水底。随着中毒程度的加深，鱼出现了身体不平衡、颤抖或者游动缓慢，身体开始立于水中，出现了反应迟钝，张口喘气等中毒现象，最后鳃部充血死亡，腹部朝上浮在水面上，或者以侧躺的姿势沉在水底。浓度高的组别从开始试验、中毒到死亡时间更短，中毒效果也更加明显。

2.2 斑马鱼对草甘膦急性毒性的LD50和安全浓度的评价

斑马鱼对草甘膦急性毒性的半致死浓度和安全浓度如表1所示。根据国家环保局发布的毒性分类标准[3]，急性毒性96h LC50<0.1 mg/L为剧毒，0.1～1.0 mg/L为高毒，1.0～10.0 mg/L为中毒，>10.0 mg/L为低毒。本实验结果表明，草甘膦的96h LC50为0.879 ppm，属于高毒农药。草甘膦是目前使用最广泛、用量最大的除草剂种类之一，如此高毒性农药的大量使用并在环境中大量残留会给环境带来了巨大的潜在风险。有研究表明近年其主要用于治理河塘、湖泊中的水生杂草，在水中的残留会对鱼类的生存产生较大的危害[4]。

表1 草甘膦对斑马鱼的LD50和SC

2.3 斑马鱼对草甘膦慢性毒性试验的结果

有机磷农药对乙酰胆碱酯酶酶活性的影响见图2。从图2可以看出，随着时间的推迟，乙酰胆碱酯酶的酶活会持续降低且浓度越高，乙酰胆碱酯酶的酶活越低。但随着时间的无限延长，乙酰胆碱酯酶的酶活下降幅度会逐渐减少，并稳定在一个确定值范围内，直至生物体死亡。高浓度有机磷农药的使用将使得水生生物出现大批量的死亡现象，即使浓度较低，毒素也会在生物体内滞留，并影响其正常新陈代谢，经过生物放大作用，甚至影响人类健康，但同时经过实验研究以及对文献的分析，发现如今水生生物已经对有机磷农药出现了抗性，且不同水域的抗性不尽相同[5-6]。Modesto等[7]研究发现，草甘膦制农药能对鱼类产生毒害作用，具体表现为：血液中的血球容积增大，体内的抗氧化酶活性改变，红细胞和白细胞数量增加。Lajmanovich等[8]报道，草甘膦对水生动物鱼、虾、青蛙、蝌蚪等产生毒害，草甘膦农药在施药48 h后降低青蛙体内乙酰胆碱脂酶和谷胱甘肽酶活性，且3.80 mg/L草甘膦可使蝌蚪大量死亡。刘晓伟等[9]也研究表明，低浓度的草甘膦对多刺裸腹溞具有毒性，LC50(48 h)=26.29 mg/L。

图2 有机磷农药对乙酰胆碱酯酶酶活性的影响

3 结 论

我国是产粮、用粮大国，农药的使用问题一直以来都是国民关心的重要问题。而农药本身的安全性与使用上的科学性的提升是对我国现阶段的发展来说至关重要的因素。本实验以斑马鱼为模式生物，尝试性地探究有机磷类农药草甘膦在斑马鱼身上的急性与慢性毒性效应。急性毒性结果表明，草甘膦属于高毒农药，其96 h LC50为0.879 mg/L；慢性毒性表明，草甘膦农药会显著得抑制乙酰胆碱酯酶的活性。那么对于草甘膦农药的使用，给出以下建议：在进行农药施药时，不要逆风和在大风天以及高温时段喷药，在保证农药适用范围之外，减少农药的污染面积，以及高温挥发对空气的污染，特别是环湖边的农田尤其不要再大风时候施药。同时应该严格控制农田中高农药的使用情况以及在使用过程中时刻观察附近生物的活动情况。