李婷婷， 李梦媛， 王雅琪， 马晓玲， 付雪艳

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学中医学院，银川 750004；3.宁夏医科大学药学院，银川 750004）

脑卒中（sotrke）亦称中风或脑血管意外，是急性脑血液循环障碍性脑血管疾病的总称，随着我国人口向老龄化趋势的发展，脑卒中的发病率逐年增加，是我国第一大致死原因[1]。现代医学认为，血脑屏障（BBC）是阻碍药物进入脑内发挥治疗脑部疾病的最大障碍，许多药物由于不能透过血脑屏障而不能发挥其作用，并且目前国内外仍没有确定的方法来解决这一问题，因此临床对于脑卒中的治疗亟待更好疗效的药物出现[2]。中医对脑卒中的认识历史悠久，有丰富的临床经验，现代医药学者在前人的基础上，开展了系列实验研究，在揭示脑卒中发病机制及阐明中药的药效物质的治疗机制方面，取得了一定成果[3]。近期的研究进展显示[4-5]，民族医药在临床以及民间应用治疗和预防脑部疾病方面疗效显著。在选方用药方面，很注重对香药的应用，方剂中芳香药所占比例为80%以上[5-6]。香药可凭借其芳香开窍作用，快速透过血脑屏障进入脑内，发挥其引药上行作用，某些复方在脑卒中方面发挥着其本有的芳香开窍作用外，还具有神经保护剂的功效[7]。本实验室在前期收集整理古籍记载治疗脑卒中的方剂后发现，单味药物胡椒、荜茇等药在治疗脑卒中方剂中出现频次较多，理论上讲，这些单味药能够在对脑卒中的治疗过程中起主要作用。本实验筛选出以上出现频次较多的单味药组成核心药对，对其能否透过血脑屏障进行进一步研究。本实验采用水蒸气蒸馏法对核心药对进行提取，通过GC-MS对核心方剂中挥发油类成分，对SD大鼠灌胃给药后取脑组织匀浆，可检测出脑脊液中挥发油类成分，确定治疗脑卒中核心方剂透过血脑屏障的挥发油类成分。

1 材料与仪器

1.1 试剂及药物

胡椒、荜茇均购自安徽泰源中药饮片有限公司，经宁夏医科大学药学院张新慧教授鉴定并依据2015年版《中国药典》检测均为合格。乙醚（分析纯、天津市北联精细化学品开发有限公司）；水合氯醛；无水硫酸钠；0.5%羧甲基纤维素钠；氢氧化钠（天津大茂公司）；氯仿（天津大茂公司）。

1.2 仪器

LD-100粉碎机（湖南省长沙市常宏制药机械设备厂）；98-I-C型电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；挥发油提取器；冷凝管；圆底烧瓶；100 μL微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪（色谱柱：Agilent DB-5MS）。

1.3 实验动物

SD大鼠60只，全雄，质量 180～350 g，购于宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SYXY（宁）2006-0001。

2 实验方法

2.1 样品的制备

2.1.1 挥发油的提取 将胡椒、荜茇以1∶1的比例粉碎，加8倍量蒸馏水，按《中国药典》2015年版水蒸气蒸馏法提取挥发油，至挥发油无增加为止，加入适量无水硫酸钠干燥后得淡黄色油状物，密闭低温保存。

2.1.2 GC-MS挥发油样品制备 取制备的挥发油0.1 mL溶解于1 mL正己烷溶液中，通过微孔滤膜过滤后备用。

2.1.3 生物样品的制备 大鼠随机分成 5组（空白组、阴性对照组、低剂量组、高剂量组、超高剂量组），每组 12只，低剂量组以1000 mg·kg-1的剂量灌胃给药［以0.5%的CMC-Na为溶剂，制成溶液（每mL含0.1 g挥发油），即得，使用前震荡均匀］，高剂量组以2000 mg·kg-1的剂量灌胃，超高剂量组以60000 mg·kg-1的剂量灌胃，空白组给同等体积的溶剂，阴性对照组给同等体积的蒸馏水，每日灌胃2次。

第5天灌服40 min后，用10%的水合氯醛麻醉大鼠（剂量：3 mL·kg-1）。剪开大鼠颈部被毛，剥离肌肉层，暴露出大鼠枕骨大孔位置，用微量进样器抽取脑脊液，同组大鼠脑脊液合并，加乙醚200 μL分两次萃取，用0.45 μm微孔滤膜滤过备用。

取出全脑，生理盐水洗净，将同组大鼠脑组织合并。加入15 mL生理盐水匀浆，3600 r·min-1离心 20 min，取上清液 1 mL，加入 2 mol·L-1NaOH 50 μL 、氯仿 2mL 振摇，3600 r·min-1离心 20 min。取出氯仿层，挥干。加入 2 mL乙醚，用 0.45 μm微孔滤膜滤过备用。

2.2 GC-MS对挥发油成分的分析

色谱柱：Agilent DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：石英毛细管柱，起始温度为100℃，以5℃·min-1速度升至150℃，再以5℃·min-1速度升至 220℃，保持 20 min；载气：氦气；柱流量：1.33 mL·min-1；分流比：不分流；进样量：1 μL；进样口温度：250℃ ；离子源温度：200℃；采集方式：全扫描；扫描范围：m/z 35～500。得到其GC-MS离子流图，利用 NIST色谱库进行自动检索鉴别其结构。

3 实验结果

3.1 药材的提取结果

胡椒、荜茇核心药对经水蒸气蒸馏法提取后得0.20988 g挥发油，其性状为淡黄色透明油状液体，提取率为0.23%。

3.2 核心方剂中挥发油成分的分析

核心方剂挥发油按本文中2.2项下GC-MS条件进行分析，该条件下各成分可得到良好分离。利用NIST色谱库进行自动检索鉴别其结构，从核心方剂挥发油中共分离和鉴定出30个化合物。见图 1和表 1。

3.3 生物样品中挥发油成分的分析

分别将空白组、阴性对照组、低剂量、高剂量组、超高剂量组SD大鼠的脑脊液（图2～6）、脑组织匀浆（图7～11）样品按本文中2.2项下GC-MS条件进行分析。通过计算机自动检索，得到生物样品中的化合物结构，阴性对照组和空白组的脑脊液和脑组织中均无挥发油成分被检出。与上述核心方剂挥发油的总离子流图相同保留时间的化学成分进行对照比较，在给药SD大鼠脑脊液和脑组织中鉴定了其中的1种化合物，为棕榈酸衍生物。

表1 核心方剂中挥发油类成分的定性鉴定结果

4 讨论

近十几年来，我国脑卒中死亡率有明显上升的趋势，脑卒中死亡在城市居民中已位居首位[1]。防治缺血性脑卒中的药物研究是国际上的热点。由于急性缺血性脑卒中严重危害着人类健康，幸存者往往留下后遗症，影响患者生活质量，也增加家庭和社会负担。为此，研究药物防治极为重要[4]。

李娟等[8]认为，具有香味的药物有较多挥发油成分，可凭借其芳香开窍作用，快速进入脑内，发挥其引药上行作用。宁国安[5]在对治疗脑卒中核心方剂的收集整理后，认为治疗脑卒中的药物有120种。收录过程发现101首方剂中，单味药物胡椒、荜茇、撒法郎、没药等香药在治疗脑卒中方剂中出现的频次较多。因此本实验在上述单味药中进行选择，将出现频次较高的药物作为核心方剂的组成药物进行试验。现代研究发现，芳香植物含有芳香的精油成分[9]，开窍药气味浓郁芳香，有开窍醒神的作用，如麝香、牛黄、冰片、苏合香等。其中挥发性成分可通过多途径、多靶点等实现开窍醒神的效应，这类药物在治疗心脑血管疾病应用中十分普遍，越来越受到广大研究者的重视[10]。本实验旨在测定药物透过血脑屏障进入脑内可能发挥治疗脑卒中作用的成分，依据上述理论，把治疗脑卒中的核心方剂中药对挥发油类成分作为主要测定对象。

本实验生物样品为SD大鼠全脑的组织匀浆液以及脑脊液。脑组织匀浆液含有大量的大血管及软脑膜上的微血管，生理盐水洗净后，也不可避免地含有脑微循环液中的成分，检测结果不能确定为透过的成分。而脑脊液为第三、第四脑室脉络丛产生的无色透明液体，充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内，血液中的血浆蛋白、大分子物质等难以进入脑脊液[11]。而在脑脊液采集的操作过程中，由于需要暴露出大鼠枕骨大孔，易因操作不当而收集到血液杂质。由于上述原因，所取的样品中会有血液残留，血药浓度将影响脑组织中药物浓度的测定[12]，本文采集大鼠脑组织和脑脊液进行检测，尽量避免微血管中挥发油成分的干扰，力求更准确地确定核心方剂中的挥发油类透过的化学成分。脑组织为实验动物处死后采集的样品，因而测得的药物浓度不能完全真实反映活体动物特征。GC-MS将气相色谱高效的在线分离能力与质谱高选择性、高灵敏度的检测能力相结合，是作为复杂体系分离分析的有效研究手段，并且是挥发油分离分析的首选方法[13]。最终本实验在SD大鼠灌胃低剂量组、高剂量组、超高剂量组脑脊液和脑组织匀浆中检测到挥发油类成分棕榈酸衍生物。胡椒、荜茇均为胡椒科植物，已有文献[14]表明，胡椒属植物中挥发油成分，具有抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，在治疗阿尔兹海默症疾病方面具有潜在用途。因此透过血脑屏障的棕榈酸衍生物的药理活性有待进一步深入研究。

本实验根据治疗脑卒中核心方剂“芳香开窍，引药上行”的特点，用水蒸气蒸馏法提取核心方剂中挥发油类成分，SD大鼠灌胃给药，运用药理学相关知识，结合GC-MS定性分析其透过血脑屏障的挥发油类成分，初步证明了棕榈酸TMS衍生物可透过SD大鼠血脑屏障进入脑组织，可能为治疗脑卒中的有效成分。现代研究表明棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖、体外迁移及成骨、成软骨分化具有积极促进作用[15]。许韬等[16]在小黄鱼内脏油的提取及其棕榈酸甘油酯低温结晶富集工艺的研究中指出，鱼油有预防心血管疾病、降低血脂、减少动脉粥样硬化发生等作用，而其含有大量的棕榈酸及其衍生物。棕榈酸作为一种长链饱和脂肪酸，是血脂重要组成成分，主要用于脑血栓、脑动脉硬化、冠状动脉硬化等病症，推测其可能与核心方剂治疗脑卒中的作用有关。