李平 龙清孟 张芸 陈大芳 谭晓山 周迪 李潇蒙 李俊 冯文武

摘要：以贵州黑山羊、酉州乌羊和努比亚3个品种为试验群体，采用PCR产物直接测序技术检测NPY-Y1R基因的多态性，并探讨其多态性对山羊繁殖性状的影响，为山羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。利用Excel计算基因频率、基因型频率;利用POPGEN软件计算遗传多态性参数纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量并对Hardy-wein-berg平衡状态进行分析;用SPSS软件对3个山羊群体NPY-Y1R基因多态性与产仔数进行相关性分析。结果表明，NPY-Y1R基因外显子中检测到1个单核苷酸多态性（SNP）位点，NPY-Y1R基因在外显子2处存在突变位点G1141A，3个山羊群体在此突变位点处均存在2种基因型，分别为AG、GG;贵州黑山羊、酉州乌羊和努比亚χ2均未达到显著水平，处于Hardy-Wein-berg平衡状态，贵州黑山羊和努比亚表现为低度多态，酉州乌羊表现为中度多态。AG基因型个体在贵州黑山羊、酉州乌羊、努比亚群体中产羔数显著高于GG基因型个体（P<0.05），呈现出AG>GG趋势。AG基因型个体的山羊在后续的试验中待进一步认证，结果可为初步判定山羊NPY-Y1R基因的突变与繁殖性能的研究奠定试验基础。

关键词：贵州黑山羊;酉州乌羊;努比亚山羊;NPY-Y1R基因多态性;繁殖性能

中图分类号：S827.3   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0171-03

神经肽Y1受体（NPY-Y1R）是含有36个氨基酸残基的一种单链多肽，广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统，与YY肽和胰多肽一起构成多肽家族[1-2]。科研人员在小鼠上研究发现，NPY-Y1R基因敲除能够损害小鼠促性腺轴，使小鼠对能量贮存感知的能力下降[3-4]，同时发现NPY-Y1R基因在下丘脑中的表达受身体能量平衡变化的影响[5]，NPY-Y1R基因在生殖功能调节与性发育中有重要作用，可能是影响山羊产羔数性状的一个主效基因[6]。储明星等在山东济宁青山羊上研究发现NPY-Y1R基因的EF型济宁青山羊产羔数比EE型多0.58只（P<0.01），并且F等位基因与济宁青山羊性早熟和高繁殖力相关[1]。樊奇在贵州白山羊和川东白山羊2个群体中发现，AB基因型山羊产羔数显著高于AA基因型（P<0.05），而在古蔺马羊、贵州白山羊和川东白山羊3个群体中AA型和AB型之间的初生质量最小二乘均值没有显著差异（P>0.05）[2]。目前，NPY-Y1R基因在山羊上的研究并不是很多，本研究以贵州黑山羊、酉州乌羊、努比亚3个山羊群体为研究对象，利用分子遗传标记辅助选择手段，研究NPY-Y1R基因在3个山羊群体中的多态性及对繁殖性状的影响，旨在为选育山羊高产仔率品种和培育高繁殖性状羊群提供理论依据，并应用于在实践生产中。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品采集自贵州省黔西南布依族苗族自治州册亨县冗渡镇贵州领头羊山地草牧业科技有限公司。采取前腔颈静脉采血方式，采集93只经产贵州黑山羊、72只酉州乌羊、63只努比亚的血液，于-20 ℃保存血液备用。整理收集3个品种山羊产仔记录数据。

1.2 血液DNA提取

血液样本DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒，用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测。通过超微量紫外分光光度計NanoDrop-ONE检测DNA D260 nm/D280 nm比值。

1.3 引物设计与合成

引物参照储明星等的引物设计方法[1]，合成NPY-Y1R基因2个外显子的引物序列见表1。引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

1.4 PCR扩增

以贵州黑山羊、酉州乌羊和努比亚基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL，其中PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，加蒸馏水至反应体系为20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

1.5 PCR产物测序

用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，凝胶成像系统观察电泳结果。选择条带单一、清晰明亮、产量高的PCR产物送上海立菲生物技术有限公司进行双向测序。用DNAStar软件中的SeqMan对序列结果进行分析。

1.6 遗传多态性分析

应用数据统计软件计算NPY-Y1R基因的基因频率、基因型频率。利用POPGEN软件计算遗传多态性参数纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC），并对Hardy-Wein-berg平衡状态进行分析。

1.7 NPY-Y1R基因与产仔数关联性分析

利用SPSS软件对3个品种山羊群体NPY-Y1R基因多态性与产仔数进行关联性分析，结果以（平均值±标准误）表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 DNA检测结果

提取的贵州黑山羊、酉州乌羊和努比亚血液基因组DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无RNA和蛋白质等污染（图1）。利用超微量紫外分光光度计Nano Drop-ONE检测DNA，D260nm/D280 nm值在1.8～2.0之间，说明DNA提取效果好，纯度高。结合图像及检测结果判断提取的DNA纯度与质量可满足后续试验要求。

2.2 PCR产物检测结果

NPY-Y1R基因PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分别在187、219 bp处有清晰条带，与预期片段大小一致。

2.3 测序结果分析

经测序发现3个山羊群体在NPY-Y1R基因的第2外显子2上的G1141A位点处有突变，并且3个山羊群体均存在2种基因型，分别为AG、GG型，存在多态性见图2。3个山羊群体在NPY-Y1R基因第2外显子1上，均未发现多态性。

2.4 NPY-Y1R基因的基因型频率和等位基因频率

3个品种山羊群体NPY-Y1R基因在G1141A位点上，不同基因型的基因型频率、等位基因频率和群体遗传多态性见表2。3个群体NPY-Y1R基因的G1141A位点G等位基因频率高于A等位基因频率，G为优势等位基因;GG基因型频率高于AG，GG为优势基因型。3个品种山羊群体χ2均未达到显著水平， 处于Hardy-Weinberg平衡状态。3个品种的基因纯合度均较高。根据多态信息含量的标准：PIC≥0.50为高度多态，0.50>PIC≥0.25为中度多态，PIC<0.25为低度多态，贵州黑山羊和努比亚表现为低度多态，酉州乌羊表现为中度多态。

2.5 NPY-Y1R基因不同基因型对不同品种羊产羔数的影响

利用SPSS软件对3个山羊群体NPY-Y1R基因多态性与产羔数进行相关性分析。从表3可以看出，贵州黑山羊NPY-Y1R基因AG、GG这2种基因型群体的的平均产羔数分别为1.75、1.15只，AG型产羔数比GG型多0.60只，2个基因型之间产羔数差异显著;酉州乌羊NPY-Y1R基因AG、GG这2种基因型群体平均产羔数分别为1.63、1.15只，AG型产羔数比GG型多0.48只，2个基因型之间产羔数差异显著;卢比亚NPY-Y1R基因AG、GG 2种基因型群体平均产羔数分别为1.50、1.17只，AG型产羔数比GG型多0.33只，2个基因型之间产羔数差异显著。

3 结论与讨论

近些年，研究人员不断地挖掘NPY-Y1R基因的突变位点，并且有研究发现NPY-Y1R基因可能是影响山羊产羔数性状的一个主效基因。国内外对NPY-Y1R基因在山羊上的研究较少。储明星等在济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊上对NPY-Y1R基因进行多态性研究发现，在G1141A位点处4个山羊品种中都存在突变，为CC型与CD型2种基因型，CC和CD基因型济宁青山羊上的产羔数差异不显著;在C1330T位点处济宁青山羊上存在突变，为EE型、EF型2种基因型，EF型济宁青山羊产羔数均值比EE型多0.58只，表明NPY-Y1R基因的F等位基因可能与济宁青山羊性早熟和高繁力相关[1]。

本试验在3个山羊群体NPY-Y1R基因外显子中检测到1个单核苷酸多态性（SNP）位点，NPY-Y1R基因在外显子2处存在突变位点G1141A，在此突变位点处3个山羊群体均存在2种基因型，分别为AG、GG。产羔数关联分析显示，G1141A位点与贵州黑山羊、努比亚试验群体繁殖性状显著相关，具体表现为贵州黑山羊、酉州乌羊、努比亚AG基因型个体的产羔数均高于GG基因型个体，本试验推断AG基因型可能是贵州黑山羊、酉州乌羊、努比亚繁殖性能的优势基因型，NPY-Y1R基因的G1141A位点可望作为贵州黑山羊、酉州乌羊、努比亚等繁殖性能选择的遗传标记而应用于山羊的分子选育。

参考文献：

[1]儲明星，冯 涛，赵有璋，等. 神经肽Y-Y1受体基因（NPY-Y1R）多态性及其与山羊繁殖性能关系[J]. 农业生物技术学报，2009，17（6）：960-966.

[2]樊 奇. 中国西南地区山羊繁殖性能相关候选基因的研究[D]. 重庆：重庆大学，2012.

[3]Gonzales C，Voirol M J，Giacomini M，et al. The neuropeptide Y Y1 receptor mediates NPY‐induced inhibition of the gonadotrope axis under poor metabolic conditions[J]. The FASEB Journal，2004，18（1）：137-139.

[4]Gamba M，Pralong F P. Control of GnRH neuronal activity by metabolic factors：the role of leptin and insulin[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2006，254：133-139.

[5]Eva C，Serra M，Mele P，et al. Physiology and gene regulation of the brain NPY Y1 receptor[J]. Frontiers in Neuroendocrinology，2006，27（3）：308-339. 9.

[6]Pellieux C，Sauthier T，Domenighetti A，et al. Neuropeptide Y （NPY） potentiates phenylephrine-induced mitogen-activated protein kinase activation in primary cardiomyocytes via NPY Y5 receptors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（4）：1595-1600.