杨雁如,刘 洋,孙杨赢,*,潘道东

(1.宁波大学食品与药学学院,浙江宁波 315800;2.浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江宁波 315800)

鸭血是肉鸭屠宰过程中产生的一种副产物,含有17%～21%的蛋白质且富含微量元素和其它一些生物活性物质[1]。但是,我国鸭血资源利用率不高,其中大多数鸭血直接当做废弃物处理掉,少数加工成鸭血制品供大家食用。目前市场上的鸭血制品主要是通过制备鸭血豆腐食用[2]。关于鸭血的报道也主要集中在鸭血豆腐品质的研究,其中有关鸭血的高值化综合利用的研究鲜有报道。如孙月萍等[3]研究发现魔芋胶和瓜尔豆胶协同作用可以显著提高鸭血豆腐的质构特性。王道营等[4]研究发现鸭血经过超声波(400 W,6 min)前处理,可以有效提高鸭血豆腐品质。鸭血是优质的蛋白质来源,通过酶法水解可以将难以消化利用的大分子蛋白质水解成小分子多肽,不但能够提供人类营养,而且具有调节人体生理机能的功效[5]。

据报道,世界上近五分之一的人口由于缺铁而出现营养问题,其主要原因是人体摄入和吸收铁的量不足[6]。铁能够以铁盐、金属螯合剂和铁螯合肽的形式提供。然而,铁盐和金属螯合剂由于其生物利用率低、对肠道有刺激作用等缺点而限制其利用[7]。有研究证明铁螯合肽在提高生物利用度、吸收性和金属稳定性方面具有较大的优势,成为科学家们关注的热点[8]。李玉珍等[9]利用碱性蛋白酶酶解冷榨花生粕蛋白得到的花生多肽液,其多肽-亚铁螯合率为85.68%。胡乔迁等[10]以芝麻蛋白为原料,利用响应面实验优化了碱性蛋白酶制备芝麻蛋白亚铁螯合物的工艺,优化后酶解产物的亚铁螯合率为72.36%。酶的选择在一定程度上会影响酶解最终产物的功能活性。碱性蛋白酶是一种内切蛋白酶,可以水解肽键、酯键、酰胺键[11-12]。赵静[13]探究了碱性蛋白酶等六种不同的蛋白酶对水解猪血红蛋白的影响,结果发现经过碱性蛋白酶酶解得到的多肽产物亚铁螯合率最高。但目前对鸭血蛋白螯合肽的研究还不够深入,利用蛋白酶水解技术将鸭血蛋白水解成小分子肽是提高利用鸭血蛋白的有效手段之一,同时说明碱性蛋白酶酶解鸭血前景广阔。

本实验以鸭血为原材料,利用碱性蛋白酶水解鸭血获得小分子肽,通过单因素实验及响应面优化试验,得到制备具有高亚铁螯合能力的鸭血酶解产物的最优工艺,同时分析酶解产物的氨基酸组成情况,以期促进鸭血的高值化利用,为酶法制备鸭血活性肽提供参考,同时为畜禽加工副产物的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭血 宁波北仑食品有限责任公司提供;碱性蛋白酶(比活力>2×105U/g)(食品级)、ferrozine(菲咯嗪)试剂 北京索莱宝科技有限公司;柠檬酸钠、氢氧化钠、氯化亚铁、硝酸钠、聚乙二醇等 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

PL403 电子精密天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;Centrifuge 5804R离心机 艾本德中国有限公司;Infinite 200 Pro全波长扫描多功能酶标仪 瑞士Tecan公司;L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司;高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸭血前处理 以10 g/L的柠檬酸钠为抗凝剂,按照血液量∶抗凝剂=100∶1添加抗凝剂,混匀[14]。4 ℃下快速运回实验室,立即用100目筛过滤,去除不可溶性杂质。为保证样品的品质以及每次试验样品的均一性,将抗凝鸭血分装在50 mL离心管中,真空冷冻干燥,并将冻干后样品(鸭血粉)于-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 鸭血酶解产物的制备 称取一定量的鸭血粉,用磷酸盐缓冲液(pH=8.0)溶解,配制成蛋白浓度为5%的鸭血溶液,用1 mol/L的氢氧化钠调节至目标pH,然后加入一定量的碱性蛋白酶在一定温度下开始酶解。酶解结束后,将反应液置于95 ℃沸水中灭酶10 min,冷却后离心(5000 r/min,20 min)取上清液,真空冷冻干燥后得到鸭血酶解产物。

1.2.3 单因素水平设计 通过查阅相关文献,本实验中选取酶添加量、pH、酶解温度和时间这四个比较显著的因素进行考察[13,15]。以亚铁螯合率为主要评价指标,水解度为辅助指标,依次探究酶添加量、pH、酶解温度和时间对亚铁螯合率和水解度的影响。当pH为10.0,酶解温度为50 ℃,酶解时间为2 h,依次设定酶添加量为4000、6000、8000、10000、12000 U/g五个水平;当酶添加量为10000 U/g,酶解温度为50 ℃,酶解时间为2 h,依次设定pH为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0五个水平;当酶添加量为10000 U/g,pH为11.0,酶解时间为2 h,依次设定酶解温度为40、45、50、55、60 ℃五个水平;当酶添加量为10000 U/g,酶解温度为50 ℃,pH为11.0,依次设定酶解时间为1.5、2、2.5、3、4 h五个水平。

1.2.4 响应面试验设计 根据单因素实验结果和Box-Behnken实验设计原理,以亚铁螯合率为因变量,对酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间这四个因素进行多因素方差分析,最后确定酶添加量、酶解温度和酶解时间这三个比较显著的因素作为自变量,进行三因素三水平优化实验,采用软件Design-Expert V8.0.6.1分别对其进行编码。表1为响应面试验因素与水平编码表。

表1 响应面试验因素与水平编码表

1.2.5 水解度(Degree of hydrolysis,DH)的测定 本文采用pH-state法测定,按照1.2.2制备酶解产物。称取一定量的鸭血粉(经1.2.1制备得到),用pH=8的磷酸盐缓冲液溶解,水解开始时用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节反应体系的pH至目标pH,另外在反应过程中每隔15 min用0.5 mol/L的氢氧化钠调节一次pH,使反应体系pH维持在固定的pH,最后通过加入碱的量来计算水解度。计算公式如下:

1.2.6 亚铁螯合率测定方法 参考Torres-fuentes等[19]方法稍加改动。将100 μg鸭血酶解产物与250 μL醋酸钠缓冲液(pH5.0,100 mmol/L)混合,加入30 μL氯化亚铁(0.01%,w/v),在37 ℃下保温30 min,加入13 μL ferrozine试剂(40 mmol/L)。用蒸馏水替代样品作总铁对照,用蒸馏水替代ferrozine试剂作空白对照。最后在562 nm处测定吸光度。

亚铁螯合率计算公式如下:

式中:A0为总铁对照吸光度;A1为样品吸光度;A2为空白对照吸光度。

1.2.7 分子量的测定 分子量测定采用凝胶渗透色谱(GPC)方法[20]。准确称取0.30 g经方法1.2.4优化后得到的鸭血酶解产物,溶于5 mL 0.1 mol/L的NaNO3溶液中,超声分散后待测。流动相:0.1 mol/L NaNO3溶液,流速为1 mL/min,紫外检测波长为220 nm。标准品:不同分子量窄分布聚乙二醇,分子量(Mp)分别为330000、176000、82500、44000、25300、20600、12600、7130、4290、1400、633、430。

1.2.8 氨基酸组成分析 参考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》[21]的方法。

1.3 数据分析

所得实验数据采用IBM SPSS Statistics 24.0软件进行单因素方差(One-Way ANOVA)的Duncan’s Multiple Range Test进行多组样本间显著性差异分析,每个试验重复3次,差异显著水平设置为P<0.05。采用Origin 8.0软件制图。利用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化实验设计和实验数据的多元回归拟合分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶添加量对亚铁螯合率和水解度的影响 如图1所示,随着酶量的增加,亚铁螯合率和水解度都呈现先升高后下降的趋势。当酶添加量为10000 U/g时,水解度和亚铁螯合率都达到最大值,分别为23.23%±0.17%、52.32%±1.3%。增加酶的添加量有利于底物与酶充分接触,加快酶解反应速度,提高水解度。当加酶量超过10000 U/g,水解度开始下降,是因为当酶与底物作用达到最大承载能力,再增加酶量反而会抑制酶解反应[22]。亚铁螯合率下降的原因是过量的酶分子会阻碍中间产物向酶解终产物的转化,从而导致酶解物的亚铁螯合率的降低[23]。所以综上考虑,选取10000 U/g为最佳酶添加量。

图1 酶添加量对亚铁螯合率和水解度的影响

2.1.2 pH对亚铁螯合率和水解度的影响 pH对亚铁螯合率和水解度的影响如图2所示。pH从8升到11,亚铁螯合率随着pH的升高而升高,之后随着pH的升高亚铁螯合率开始下降。水解度与亚铁螯合率呈现一定的相关性,也是随着pH的升高呈现先增加后降低的趋势,在pH=11时水解度达到最佳,为31.22%±0.26%,此时亚铁螯合率为61.27%±0.65%。赵聪等[24]在研究灰树花蛋白酶解工艺的试验中研究结果与本实验类似,随着pH的升高,亚铁螯合能力和水解度也均呈现先升高后降低的趋势。酶解反应体系中pH的改变会直接影响蛋白酶分子的空间结构、底物分子的解离状态以及酶与底物的结合,从而致使水解度发生变化,影响酶解产物的螯合活性[25-26]。另外研究表明,过高的pH意味着溶液中OH-离子增加,游离铁离子与OH-结合形成羟合Fe2+的机会增加,也不利于鳌合铁的生成[27]。同时在pH为11时,亚铁螯合率和水解度达到最高,所以本实验中选择pH=11作为最佳酶解pH。

图2 pH对亚铁螯合率和水解度的影响

2.1.3 酶解温度对亚铁螯合率和水解度的影响 温度对亚铁螯合率和水解度的影响如图3。温度在40～50 ℃范围内,亚铁螯合率随着温度的上升明显增强,在50～60 ℃范围内,亚铁螯合率呈下降趋势。在50 ℃时亚铁螯合率达到最大,为53.59%±1.10%,此时水解度为29.20%±0.57%。张墨楠[28]在探究不同温度对大豆蛋白酶解液亚铁螯合反应的影响时,结果发现当温度为37 ℃时亚铁螯合活性最高,过高或过低的温度都不利于亚铁的螯合。随着温度的升高,水解度先升高,之后变化不明显。当温度较低时,酶和蛋白分子的运动速率均较低,不利用反应的进行;当温度过高时,会导致酶活性减弱甚至丧失,抑制反应的正向进行[29-30]。所以,为获得具有高亚铁螯合活性的鸭血酶解产物,选择温度50 ℃为最优酶解温度。

图3 温度对亚铁螯合率和水解度的影响

2.1.4 酶解时间对亚铁螯合率和水解度的影响 不同酶解时间对亚铁螯合率和水解度的影响如图4所示。由图4可知,亚铁螯合率随着酶解时间的延长先升高后降低,在2 h时达到最大值,为61.46%±0.43%。水解度在1.5～3 h内随着酶解时间的增加而不断升高,之后再增加酶解时间水解度变化不大。一般多肽与金属的螯合反应都在较短时间内完成,所以在2 h时酶解产物的亚铁螯合率达到最高[28]。王铮等[31]利用酶解法制备雁血多肽,在探究酶解工艺对水解度的影响时发现,当酶解时间达到一定程度时,此后再增加反应时间,水解度几乎不再增加。随着酶解时间的增加,水解度一直呈上升趋势,尤其在前2 h内,水解度上升较多。但随着时间的延长,反应产物积累,抑制了蛋白酶的活力,从而导致水解度上升不明显,同时过度水解会不利于亚铁螯合反应。所以选择2 h为最佳酶解时间。

图4 时间对亚铁螯合率和水解度的影响

2.2 响应面优化实验设计及结果

2.2.1 响应面实验结果 综合以上单因素实验结果与分析,以亚铁螯合率为指标,应用Design Expert 8.0.6软件设计三因素三水平优化实验,测定结果如表2所示,共计17组实验。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

2.2.3 响应面交互作用分析 影响亚铁螯合率各因素交互作用响应面如图5所示。通常来说,两个因素间交互作用的显著性与响应面曲线的弯曲程度和等高线的形状有关,等高线为椭圆型则表示两个因素之间交互作用显著,响应面曲线越陡峭表示单个因素影响越显著,反之表示不显著[32]。由图A2可以看出,酶添加量与酶解温度交互作用极显著(P<0.01)。其中,沿X1轴方向的响应面坡度明显比沿X3轴方向的要陡峭(图A1),说明酶添加量相对于酶解时间对亚铁螯合率影响更为显著。图A3显示沿X2轴方向的响应面坡度明显比沿X3轴方向的要陡峭,说明酶解温度影响更大。从X1与X2交互作用图中发现沿X2轴方向的响应面坡度比沿X1轴稍微平缓一些,说明酶解温度的变化对响应值的影响更为小一些。该结论与方差分析结果一致,再次验证了响应面模型的可靠性。

图5 各因素交互作用对亚铁螯合率影响的响应面图

2.2.4 最佳酶解条件的确定及验证 利用Design Expert软件的优化,得到最佳工艺参数:酶添加量9800 U/g,酶解时间为2.05 h,温度为49.6 ℃。考虑到实际操作情况,将酶解条件修正为:酶添加量9800 U/g,酶解时间为2 h,温度为50 ℃。为验证优化后模型的可靠性,做3次平行实验,得到实际平均亚铁螯合活性为65.36%,模型预测的亚铁螯合率为66.71%。实际结果与预测数值差异为1.35%,未超过5%,该模型验证合理。

2.3 鸭血酶解产物分子量分布

鸭血酶解产物分子量分布结果如图6和表4所示。相比于大分子蛋白质和单一氨基酸,小分子多肽更易被人体吸收利用,所以对酶解液分子量分布的考察极为重要[33]。由图6和表4可知,经过碱性蛋白酶酶解后得到的鸭血酶解产物,其相对分子质量小于1500 Da的组分占比为72.01%,其中小于800 Da的组分占比为39.66%。Vattem等[34]、Guo等[6]、Lee等[35]利用酶解技术分别从蛋清蛋白源、阿拉斯加鳕鱼皮和猪血浆蛋白制备得到铁螯合肽,其分子量均小于1500 Da。此外,Cian等[36]从酶解红藻蛋白中制备得到两个多肽组分,分子量分别为270和1013 Da,其中270 Da的多肽比1013 Da的多肽亚铁螯合活性更强。以上研究表明,多肽的分子量大小与金属的螯合能力有着一定的相关性,低分子量多肽具有相对更强的螯合能力[37]。

图6 标准蛋白曲线和酶解液分子量分布图

表4 不同分子量分布

2.4 鸭血酶解产物氨基酸组成分析

酶解产物的螯合活性不仅取决于肽的分子量大小,它和组成多肽的氨基酸序列及其中的特殊基团也有很大的关系[38]。由表5可知,酶解产物中氨基酸总量约占76.25%。其中Lys、Glu、Asp、His含量较高,分别占总氨基酸含量的10.25%、13.95%、9.67%、8.89%。Wu等[39]研究鳕鱼皮明胶水解物的氨基酸组成发现,除了Gly、Pro、Ala含量较高,与金属螯合活性有关的Lys、Glu、Asp、His分别占氨基酸总量的2.7%、9.0%、5.7%、1.3%。Glu和Asp因具有环状结构能够与亚铁等金属离子结合,形成稳定的金属螯合物[40]。不同的氨基酸对铁螯合活性的贡献与原料的种类有一定的关系。如在乳清蛋白酶解产物中,Ala、Lys和Phe对铁螯合活性贡献最大[41]。Lucia等[42]在研究酵母蛋白亚铁螯合肽时发现,His、Lys和Arg含量较水解物中有所提高。此外,酶的选择和酶解过程的控制都会影响最终酶解产物的氨基酸组成分布。碱性蛋白酶为非特异性蛋白酶,其酶切的肽段中Glu、Lys等氨基酸含量较多,因此具有较高的亚铁螯合活性[6,24]。有研究发现,具有较好亚铁螯合能力的多肽通常还与Cys、Arg、Ser等氨基酸有着紧密的联系[39,43]。通过氨基酸组成分析发现,碱性蛋白酶作用于鸭血蛋白形成的小分子多肽具有良好的亚铁螯合活性。

表5 酶解产物氨基酸组成分析

3 结论

本试验以亚铁螯合率为指标,结合单因素实验和响应面试验优化得到碱性蛋白酶水解鸭血制备具有高亚铁螯合活性的酶解产物的最优酶解工艺为:酶添加量为9800 U/g、温度为50 ℃、pH11、时间为2 h,在此工艺下模型预测亚铁螯合率为66.71%,实际亚铁螯合率可达65.36%,实际结果与预测值之间的误差为1.35%,模型验证合理。酶解产物中分子量低于1500 Da的小肽占比为72.01%,氨基酸组成分析发现,酶解产物中具有亚铁螯合活性多肽的氨基酸(Lys、Glu、Asp、His)含量较高,分别占总氨基酸含量的10.25%、13.95%、9.67%、8.89%,这些氨基酸对亚铁离子有较强的螯合作用。本研究结果为进一步开发鸭血等畜禽血液铁螯合肽提供了理论依据。