叶婷婷,张建芬,陈 虹

(浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015)

白腐真菌(White rot fungi)是一类高等担子菌,主要包括栓菌属(Trametes)、层孔菌属(Phellinus)、木耳属(Auricularia)、纤孔菌属(Inonotus)、革盖菌属(Coriolus)、侧耳属(Pleurotus)和密孔菌属(Pycnoporus)等[1]。白腐真菌是自然界中木质素降解的主力军,主要通过分泌胞外木质素降解酶来实现[1]。其木质素降解酶主要包括漆酶(Laccase)、木素过氧化物酶(Ligninperoxidase,LiP)和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)等三种[2]。漆酶是木质素降解酶中研究最深入的一种,它是蓝色多铜氧化酶家族中一类含铜的多酚氧化酶,具有良好的应用价值[3-5]。漆酶最早发现于漆树中,后来发现其广泛存在于植物、微生物中,而白腐真菌是漆酶的主要产生菌[3-5]。漆酶的底物作用范围广,在造纸、染料脱色、环境污染治理等方面具有巨大的应用潜力和广阔的市场前景[6-8]。

近年来,染料在制革业、纺织业、造纸业和食品加工业中广泛应用[9]。染料如未经处理直接排放到环境中,会造成水体严重污染、危害水生生物和人类的健康[10]。白腐真菌及其漆酶处理是染料降解最为有效方式之一[9,11-15]。血红栓菌(Trametessanguinea)又名血红密孔菌(Pycnoporussanguineus),属于多孔菌科、密孔菌属[16]。一般生长于杨、柳、桂花等阔叶树的枯木上,被害木材在初期为橘红色,后期为白色腐朽[17]。该菌能够产生包括漆酶在内的多种木质素降解酶[18-21]。

本研究从自然界中采集血红栓菌的子实体,分离菌丝后,利用形态学观察与分子生物学鉴定确定其分类学地位,优化漆酶的发酵条件,利用其所产漆酶降解染料,为白腐真菌在染料废水脱色的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

真菌子实体 于2019年6月采自杭州西溪湿地,装入无菌袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存;2,2′-联氨-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、刚果红、孔雀石绿和亚甲基蓝 购于美国Sigma 公司;酒石酸铵、葡萄糖、KNO3、MgSO4、NaH2PO4、CuSO4、CaCl2、KCl、ZnSO4等 购于国药集团化学试剂有限公司;小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、马铃薯 市售产品。

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;YAMATO立式压力蒸汽灭菌器、Eppendorf离心机、Xmark连续波长酶标仪 美国伯乐公司;MA100光学显微镜 尼康仪器(上海)有限公司、ZWY-1112D立式摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;LRH-1500F生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 PDA培养基(g/L):马铃薯200、葡萄糖20、琼脂20。基础产酶培养基(g/L):玉米粉20、酵母粉5、MgSO40.5。

1.2.2 菌丝体的分离 菌株子实体采自杭州西溪湿地树桩上。采用组织分离法分离真菌子实体的菌丝体。将新鲜菌株子实体表面消毒后,切成小块后植入PDA平板上,于28 ℃培养。待长出菌丝后转移至新鲜的PDA平板纯化,多次纯化直至获得纯菌株。

1.2.3 分离菌株的鉴定 形态鉴定:菌丝纯培养经PDA平板活化后转接到新鲜的PDA平板中央,28 ℃培养5～7 d,观察平板菌落形态。采用插片法,在光学显微镜下观察菌株的菌丝形态和孢子形态。

分子鉴定:采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。利用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。PCR反应为总体积25 μL体系,包括2×Taq Mastermix 12.5 μL,引物各1 μL,模板DNA1 μL。ITS区扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性40 min,54 ℃退火30 min,72 ℃延伸45 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经电泳分析后,委托上海生工生物有限公司进行测序。将测序的DNA序列提交GenBank进行BLAST比对,利用MEGA 7.0进行Clustal X多序列比对、Neighbor-Joining(NJ)构建系统发育树,分析其同源关系,确立分类学地位。

1.2.4 菌株的发酵培养酶活性测定 以新鲜菌饼接种于PDA平皿上,28 ℃培养5 d。将菌饼接种到基础产酶培养基中,28 ℃、150 r/min振荡培养。在接种的第6 d开始,每隔1 d取发酵液1 mL,10000 r/min离心5 min,上清液经适当稀释后测定其漆酶活性,以监测其产酶峰值。

采用ABTS法测定漆酶酶活,反应体系为1 mL,含HAc-NaAc(pH4.5)缓冲溶液0.78 mL,稀释后的酶液20 μL和1 mmol/L的ABTS 100 μL,每30 s在酶标仪上读取一次420 nm下的吸光值。酶活力单位(U)定义:每分钟内催化1 μmol ABTS生成产物所需的酶量。漆酶酶活按文献[22]公式计算,其中420 nm波长处ABTS摩尔消光系数ε420=3.6×104L/(mol·cm)。

1.2.5 漆酶发酵条件优化 最适碳源:基础产酶培养基中分别添加20 g/L的小麦淀粉、马铃薯淀粉和木薯淀粉作为碳源,培养基其它成分不变,28 ℃、150 r/min摇床培养6、7 d,测定发酵液漆酶酶活。

最适氮源:在确定最适碳源的基础上,基础产酶培养基中分别以5 g/L酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、酒石酸铵、硝酸钠为氮源,28 ℃、150 r/min摇床培养6、7 d,测定发酵液漆酶酶活。

诱导剂选择:在确定碳、氮源种类的基础上,在培养基中分别加入1 mmol/L的维生素B、愈创木酚、CuSO4和硫酸镁作为诱导剂,以培养基不加诱导剂作为对照,28 ℃、150 r/min摇床培养7～9 d,测定发酵液漆酶酶活。

250 mL摇瓶装液量:在确定培养基组成的基础上,调节摇瓶装液量分别为25、50、100、125、150 mL,28 ℃、150 r/min摇床培养7～9 d,测定发酵液漆酶酶活。

1.2.6 菌株的漆酶同工酶谱分析 采用10%的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析漆酶同工酶。分别取7.5和15 μL发酵液进行电泳分析,电泳后蛋白胶在1 mmol/L ABTS(HAc-NaAc,pH4.5缓冲液)溶液中染色20 min,分析其同工酶谱组分。

1.2.7 漆酶对染料的脱色作用 初始反应体系10 mL,由染料溶液(100 mg/L)、粗酶液(200 U/L)和0.1 mol/L的醋酸钠缓冲液(pH4.5)组成。反应液在30 ℃恒温振荡水浴锅中反应,每隔1 h取0.3 mL反应液分析,直至48 h。以加入等量灭活漆酶酶液的反应体系为对照,计算脱色率,脱色率按文献[23]方法计算,即脱色率(%)=[(A0-At)/A0]×100(其中A0和At分别为反应0 h和t h的吸光度)。通过改变反应体系中的pH(2.8、3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0)和温度(25、30、35、40、45、50、55、60 ℃),考察不同条件对脱色的影响。

1.3 数据处理

每组实验平行3次,采用Excel进行数据处理,采用Origin 8.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 真菌的分离鉴定

2.1.1 真菌的分离和形态鉴定 白腐真菌的采集:2019年6月16日上午,在浙江省杭州市西溪湿地的日本晚樱树上,采集到野生真菌子实体(命名为Strain H-1),用无菌信封装好,于冰箱冷藏保存备用。从子实体形态上可以初步判断它是一种白腐真菌。

参照《中国野生大型真菌彩色图鉴》[24]进行白腐真菌种类初步鉴定。采集到的白腐真菌如图1A和图1B所示,其菌盖为扇形,菌盖直径达2～5 cm,厚2～4 mm,表面平滑,正面呈浅的暗橘红色,反面呈鲜艳橘红色。Strain H-1无菌柄,菌管为圆形且管口较为细小。根据Strain H-1子实体形态特征,初步鉴定其可能为红栓菌。平板菌落形态如图1C所示,Strain H-1在PDA平板上生长良好,长速较快,菌丝初期为白色绒毛状,生长2～3 d后,菌丝呈现橘红色。显微镜观察如图1D所示,Strain H-1的菌丝发达,透明且光滑,孢子卵圆形,透明。

图1 白腐真菌Strain H-1的形态

2.1.2 白腐真菌的分子生物学鉴定 以Strain H-1的基因组DNA为模板,以ITS1和ITS4为引物,成功扩增了它的ITS区序列。如图2所示,扩增产物电泳后呈现明亮整齐的单一条带,片段大小为609 bp,基本符合ITS区序列大小,可以进一步用于测序。将它交由上海生工生物工程有限公司测序,将测得序列提交NCBI数据库进行BLAST比对分析,结果表明:Strain H-1与TrametessanguineaMH142019.1(血红栓菌/血红色陀螺孔菌)同源性为99%以上。以GanodermalucidumKX358403.1(灵芝)为外群种构建的进化树见图3,可知Strain H-1与菌株Trametessanguinea聚为一支,且亲缘关系最近。前期形态鉴定实验表明此野生白腐真菌可能为红栓菌,分子鉴定、进化树分析与形态鉴定结果相吻合。因此,Strain H-1鉴定为血红栓菌TrametessanguineaH-1。

图3 菌株H-1基于ITS序列的系统发育进化树

图2 ITS1区PCR扩增产物凝胶电泳图

2.2 血红栓菌产漆酶的培养条件优化

2.2.1 碳源优化 研究碳源对血红栓菌H-1产漆酶的影响,结果如图4所示,在培养至第6 d和第7 d时,以小麦淀粉为碳源,产漆酶的酶活力均最高,其次以马铃薯淀粉为碳源，而以木薯淀粉为碳源,产漆酶的酶活力最低。因此,选择小麦淀粉为血红栓菌H-1产漆酶的碳源。

图4 碳源对血红栓菌H-1发酵产漆酶的影响

2.2.2 氮源优化 考察氮源对血红栓菌H-1产漆酶的影响,结果如图5所示,以酒石酸铵为氮源,血红栓菌H-1产漆酶的酶活力最高,其次为硫酸铵。据文献报道,以酒石酸铵为氮源,有利于白腐真菌产漆酶[23]，本文的实验结果与文献一致。以硝酸钠为氮源,血红栓菌H-1产漆酶的酶活力最低,说明血红栓菌H-1对铵态氮的利用较好,而对硝态氮的利用较差。此外,以酵母粉和蛋白胨为氮源时,其漆酶酶活力都不高,说明血红栓菌H-1对无机氮源的利用要优于有机氮源。因此,选择酒石酸铵为血红栓菌H-1产漆酶的氮源。

图5 氮源对血红栓菌H-1发酵产漆酶的影响

2.2.3 诱导剂选择 研究诱导剂对血红栓菌H-1产漆酶的影响,结果如图6所示,以硫酸铜为诱导剂,产漆酶的酶活力最高,远远高于其它诱导剂,其次为愈创木酚。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,铜离子位于其酶活中心,因此铜离子能诱导漆酶基因表达,从而调控漆酶的合成[23]。此外,愈创木酚等小分子酚类化合物对漆酶具有较好的诱导作用,也常用作诱导剂。刘文华等研究发现香兰素和愈创木酚对Trameteshirsuta漆酶的分泌有促进作用[25]，本实验结果与文献报道的一致。因此,选择硫酸铜为血红栓菌H-1产漆酶的诱导剂。

图6 诱导剂对血红栓菌H-1发酵产漆酶的影响

2.2.4 摇瓶装液量优化 研究摇瓶装液量对血红栓菌H-1产漆酶的影响,结果如图7所示,当250 mL摇瓶的装液量分别为25 mL和100 mL时,漆酶酶活都比较高,考虑到培养量,选择装液量为100 mL发酵产漆酶。

图7 摇瓶装液量对血红栓菌H-1发酵产漆酶的影响

经优化后,血红栓菌H-1以小麦淀粉为碳源,酒石酸铵为氮源,以硫酸铜为诱导剂,250 mL摇瓶装液量为100 mL,28 ℃、150 r/min摇床培养7 d,漆酶酶活力达到3527.8 U/L,比优化前提高了约30倍。血红栓菌H-1漆酶酶活力比文献报道的略低[26],今后,还需进一步优化其培养基配方和发酵培养条件。

2.3 血红栓菌产漆酶的酶谱分析

采用10%的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析血红栓菌H-1漆酶的同工酶,发酵上清液经电泳后ABTS染色分析。结果如图8所示,在大约45 kDa处,可见一清晰的绿色色带,表明血红栓菌H-1所产漆酶可能为单一蛋白,且分子量约为45 kDa。据报道[10],血红密孔菌(PycnoporussanguineusMX5)3个漆酶同工酶Lacl、Lac2、Lac3均为单体蛋白,分子量分别为61.8、61.8和60.6 kDa。因此,不能排除本实验血红栓菌 H-1所产漆酶为多个分子量相近蛋白的可能。

图8 漆酶的活性PAGE电泳分析

2.4 漆酶对染料的脱色研究

2.4.1 pH对漆酶脱色的影响 研究不同pH缓冲体系下,反应温度30 ℃,血红栓菌H-1漆酶对工业染料脱色的影响,结果如图9所示,血红栓菌漆酶对试验三种染料均具有较好的脱色效果,在pH3.2(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)和pH5.2(醋酸-醋酸钠缓冲液)附近,脱色效果均达到峰值。其中脱色效果最好的是刚果红和孔雀石绿,在pH3.2和pH5.2时,刚果红脱色率分别达到54.2%和65.4%,孔雀石绿脱色率分别达到61.1%和47.5%。在pH3.2和pH4.8时,血红栓菌H-1漆酶对亚甲基蓝的脱色率分别达到24.1%和31.3%。此外,在pH2.8～6.0之间,血红栓菌H-1漆酶对试验三种染料的脱色率有两个峰值,其可能原因血红栓菌H-1漆酶有2个或者多个同工酶,它们有不同的最适反应pH。据报道[10],血红密孔菌(Pycnoporussanguineus),毛栓菌(Trameteshirsuta)等白腐菌有多个漆酶同工酶。

图9 不同pH下漆酶对染料的降解

2.4.2 温度对漆酶脱色的影响 研究不同温度下,pH5.0,血红栓菌H-1漆酶对工业染料脱色的影响,结果如图10所示,血红栓菌漆酶对亚甲基蓝、刚果红和孔雀石绿均具有较好的脱色效果,在30和50 ℃时,脱色效果均达到峰值,可能原因血红栓菌H-1漆酶有多个同工酶,它们有不同的最适反应温度。

图10 不同温度下漆酶对染料的降解

刚果红是典型的双偶氮染料[20],孔雀石绿是典型的三苯甲烷染料[14],亚甲基蓝是典型的噻嗪染料[27],它们的化学性质都比较稳定,难以在自然环境中被降解,且具有高毒性、高残留性和“三致”作用,它们能在环境中积累,并且通过食物链进入人体,严重危害人类健康[27]。本研究中,血红栓菌H-1胞外漆酶对试验的三种典型染料均有明显的脱色作用,表明该漆酶在染料降解方面具有较大的应用前景。后续为进一步提高漆酶对染料的脱色效果,可考察在介体存在下,血红栓菌H-1漆酶对染料的脱色作用。

3 结论

本文采用组织分离法从采集的白腐真菌子实体中分离菌丝体,通过形态学观察和分子生物学法鉴定该白腐真菌为血红栓菌(TrametessanguineaH-1)。通过单因素实验优化了血红栓菌H-1产漆酶的培养条件,结果表明,得到的优化培养基配方为:小麦淀粉20 g、玉米粉20 g、酒石酸铵5 g、MgSO40.5 g,CuS042 mmol/L。优化的培养条件为:250 mL的摇瓶装液量为100 mL,28 ℃条件下培养7 d,发酵液漆酶酶活为3527.8 U/L,比优化前提高了约30倍。然后通过Native-PAGE分析血红栓菌H-1漆酶的同工酶,结果显示其漆酶可能为大小约45 kDa的单一蛋白。染料脱色实验表明血红栓菌H-1漆酶对三种染料均具有较好的脱色效果,在没有介体存在下,在pH3.2和pH5.2附近,温度为30和50 ℃时,脱色效果均达到峰值。刚果红、孔雀石绿和亚甲基蓝脱色率分别达到65.4%、47.5%和31.3%。从自然界分离到的血红栓菌H-1能产生较高活性的漆酶,在染料废水脱色的方面具有一定的应用前景。