肖 岚,何 莲,安潘宇,李 娟,鲜丹丹,杨 瑶,杜双巧

(1.四川旅游学院食品学院,四川成都 610100;2.成都农业科技职业学院,四川成都 610000)

坛子肉是四川安岳地区的一种特色发酵肉制品,是将猪五花肉经油炸之后拌入香辛料,一层萝卜丝一层肉入坛发酵而成,因入陶坛发酵而成,故名坛子肉。由于坛子肉是在自然条件下发酵,发酵所需的微生物主要来自入坛的萝卜丝所携带的野生菌株,因此气候条件、发酵时间、萝卜丝的初始微生物群落结构、坛子肉以及萝卜丝本身的化学组成等都可能影响坛子肉的微生物种群分布、菌落演替、结构组成;而不同种类的微生物对坛子肉的色、香、味甚至安全性等都有较大影响,故研究坛子肉中微生物群落结构可调控和提升其产品质量。

在发酵肉制品领域,国内外学者主要是对发酵火腿[1-4]、发酵香肠[5-6]、发酵腊肉[7]、发酵鱼[8-9]等的微生态系统进行了系统解析,甚至研发出专用发酵剂,关于安岳坛子肉发酵过程中微生物的演替规律和多样性分析的报道较少。安岳坛子肉仍采用手工作坊式生产,依靠自然发酵,故存在产品质量不稳定的问题,因此,本文基于Illumina MiSeq高通量测序平台对坛子肉、萝卜丝中细菌的16S rDNA V3-V4区进行测序,以期获得坛子肉中细菌的物种构成以及不同发酵时间样品之间的差异关系,为坛子肉的标准化生产调控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪五花肉 四川三元杂交内江猪,屠宰后未排酸成熟,备用;白萝卜丝 水分含量20%,市购;粪便DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Stool DNA Kit) 上海哈研生物科技有限公司;MiSeq Reagent Kit V3 美国Illumina公司;DNA提取试剂盒 E.Z.N.A.®Stool DNA Kit。

Illumina Miseq测序仪 美国Illumina公司。

1.2 实验方法

1.2.1 坛子肉的制备 根据四川安岳县普州坛子肉食品有限公司提供的工艺参数,坛子肉及萝卜丝制备的流程如下:

坛子肉加工工艺流程如下:猪五花肉(采用五花肉作为原料,切配成500 g左右的长条状)→晾干表面水分(自然晾干,冬季风干2～4 h,肉块表面干爽为止)→油炸(采用猪油进行油炸,油温160～180 ℃,油炸5～8 min,表面微黄即可)→腌制码味(将滤过油的肉均匀涂抹上食盐、白酒以及香辛料,放置2～3 h即可入坛腌制发酵)→入坛发酵75 d(一层萝卜丝一层肉的方式入烧制的土坛中厌氧发酵,水封隔绝空气)。

萝卜丝的处理:以外购水分含量约20%左右的白萝卜丝为原料,加入5%的食盐入坛密封腌制3 d,出坛后即为腌制萝卜丝;将腌制萝卜丝与入坛发酵75 d萝卜丝混合均匀(1∶1质量比),即得到混合萝卜丝。一层萝卜丝一层肉的方式(混合萝卜丝与肉一起入坛)入坛厌氧发酵75 d,即入坛发酵75 d萝卜丝。

取样:分别在入坛发酵20、40、60、75 d进行取样,坛子肉和萝卜丝各200 g左右,经真空包装后保存于-80 ℃,备用。

1.2.2 DNA提取和测序 采用 DNA 提取试剂盒提取不同发酵时间(20、40、60、75 d)的坛子肉和萝卜丝样品中的微生物总DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度,同时采用紫外分光光度计检测DNA浓度。

扩增的目标区域是16S rDNA基因的V3-V4区域,通用引物序列为[10]:338F ACTCCTACGGGAGGCA GCAG,806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。扩增结束后,利用 2% 琼脂糖凝胶电泳检查扩增效果,并采用AMPure XT beads试剂盒对目标片段进行回收。

采用Qubit对纯化后的PCR产物进行定量并建立文库,合格文库的浓度应在2 nmol/L以上。将合格的各上机测序文库(Index序列不可重复)进行梯度稀释,并经NaOH变性为单链进行2×300 bp的双端测序。

1.3 数据处理

由于序列数量庞大,首先需要根据barcode信息对样品进行数据拆分;利用overlap对双端数据进行拼接,并进行质控、嵌合体过滤,获得高质量的有效数据。本实验对最终获得有效数据进行97%的相似度聚类,为了降低假阳性率,会过滤singleton序列,获得最终的OTU丰度及代表序列,进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。不同发酵时间的坛子肉和萝卜丝均采集3个平行样品。

2 结果与分析

2.1 坛子肉和萝卜丝样品的微生物Alpha多样性分析

Alpha多样性[11](Alpha diversity)是指一个特定环境或生态系统内的多样性,主要用于反映物种丰富度、均匀度以及测序深度。对测序进行拼接、过滤,8组样品获得有效序列数平均为27563条,按照97%的序列相似度将这些序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)[12],得到每个cluster的序列及其代表序列即为OTU,用于统计每个OTU序列和丰度进行下游分析。发酵20 d坛子肉平均OTU数量687、40 d坛子肉654、60 d坛子肉814、75 d坛子肉507;发酵20 d萝卜丝平均OTU数量380、40 d萝卜丝431、60 d萝卜丝872、75 d萝卜丝452。

图1为不同发酵时间的坛子肉和萝卜丝的等级丰度图(rank abundance curve),用来展示不同样品(即用不同曲线表示)的菌群相对丰度和均匀度。由图1可知,所有曲线在横轴的范围均较大,即所有样品的菌群数量(被排序的OTU数量)均较多,菌群的丰富度均较高;在垂直方向,所有曲线的梯度均较陡峭,说明所有样品的菌群种类分布不均匀。

图1 不同发酵时间坛子肉和萝卜丝的等级丰度图

不同发酵时间的坛子肉以及萝卜丝样品的Alpha多样性指数见表1,各样品的菌群覆盖度指数(Goods coverage)均能达到98%以上,表明本次测序相对于整体样品的覆盖程度是非常高的。Chao1指数用于估计样品中所含OTU数目。按照发酵时间先后,坛子肉的平均Chao1指数分别为491.84、466.93、596.35和390.03,萝卜丝的平均Chao1指数分别为254.57、338.36、585.05和311.92。结果提示,60 d坛子肉及萝卜丝的中所含OTU数目最高。

表1 不同发酵时间坛子肉和萝卜丝的生物群落丰富度和多样性指数(n=3)

observed species指数表示该样品中含有的物种数目。按照发酵时间先后,坛子肉的平均observed species指数分别为258.67、237.00、412.33和390.03,萝卜丝的平均 observed species指数分别为138.33、154.67、345.33和124.67。结果提示,60 d坛子肉和萝卜丝中含有的物种数目最高。Simpson指数越高,意味着样品物种多样性越高。Shannon指数越高反映 OTU 出现的紊乱和不确定性越高。60 d发酵的坛子肉及萝卜丝的Simpson指数、Shannon指数均最高。综上,随着发酵时间延长,萝卜丝与坛子肉中的细菌菌群丰富度和多样性增加,特别是坛子肉中细菌菌群丰富度和多样性增加较快,这可能与萝卜丝随坛子肉入坛加速发酵进程[13-14]有关。然而,发酵75 d坛子肉中的细菌菌群丰富度和多样性迅速下降,可能是优势菌群的大量繁殖抑制杂菌的生长,并导致坛子肉及萝卜丝pH下降从而进一步抑制杂菌的生长。

2.2 坛子肉和萝卜丝样品中物种群落结构差异的比较

Beta多样性主要用于研究不同样品之间的物种群落结构差异,而Alpha多样性只是用来描述单个样品的物种多样性。为比较不同发酵时间样品的细菌群落相似性,采用Beta多样性分析中常用的主成分分析法(PCA,Principal Component Analysis)和算术平均数无权重对组法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean,UPGMA)进行比较分析,如果样品间的细菌群落组成越相似,则它们在PCA图、UPGMA 层次聚类分析图中的距离越接近[15]。UPGMA层次聚类分析包括unweighted unifrac和weighted unifrac两种算法,其中unweighted unifrac计算样品之间距离时更侧重描述由群落构成差别而导致的样品间的差异,weighted unifrac计算样品之间距离时更侧重于描述由群落物种丰度梯度改变而导致的样品间的差异。

如图2所示,不同分支代表不同发酵时间的坛子肉和萝卜丝,其细菌群落结构有较大差异。20 d坛子肉与20 d 萝卜丝、40 d坛子肉与40 d萝卜丝分别位于两个不同的分支,说明发酵初期(发酵过程的前半段,即发酵前 40 d)的坛子肉和萝卜丝的细菌群落结构的差异较大。60 d坛子肉与60 d萝卜丝、75 d坛子肉与75 d萝卜丝分别位于同一分支,说明发酵后期(发酵过程的后半段,即发酵40～75 d)的坛子肉和萝卜丝的细菌群落结构较为接近。这是因为萝卜丝入坛时携带大量微生物菌群,而坛子肉在入坛前经过高温油炸,表面微生物几乎杀死,萝卜丝随坛子肉一起入坛发酵,坛子肉为萝卜丝中的微生物提供碳源、氮源从而促进其大量繁殖,随着发酵时间延长,坛内微生物趋于平衡,因此坛子肉和萝卜丝在发酵前期的细菌群落结构的差异较大,发酵后期的差异较小。

图2 UPGMA层次聚类分析

另外,75 d坛子肉的3个平行样品中有1个样品离散在群体之外,提示这个样品与其他2个样品的相似性不高,可能与发酵过程中的开坛取样有关。在实际生产中,为确保坛内微生态环境的稳定,减少杂菌的污染,采用的是密封发酵。

PCoA分析是最适用于展现样品组间与组内的微生物多样性的方式,是基于UPGMA(Weight-UniFrac)层次聚类分析获得的PCoA分析2D示意图。如图3所示,通过对同一发酵时间点的坛子肉与萝卜丝在PCoA分析的2D示意图中的距离比较发现,75 d坛子肉与75 d萝卜丝的距离最近,说明75 d坛子肉与75 d萝卜丝的微生物结构组成最为相似,这应该与发酵后期的坛内微生物组成趋于平衡有关系。

图3 PCoA分析2D示意图

2.3 不同发酵时间的坛子肉、萝卜丝的物种注释

采用RDP[16]和NT-16S数据库对不同发酵时间坛子肉、萝卜丝中的微生物做物种注释,采用Blast软件进行分类比对,具体的参数设置如下:RDP置信度0.8,blast比对最小identity为90%,最小query覆盖度为80%,最大evalue为1e-5,evalue区间倍数为10倍。

聚类柱状图即对丰度前20的物种进行Bray-Curtis距离聚类,以展现物种分类及样品距离之间的关系,如图4所示,随着发酵时间的延长,坛子肉和萝卜丝中的细菌群落的物种分类越少,厚壁菌门(Firmicutes)逐渐成为了优势物种。不同发酵时间坛子肉中厚壁菌门的丰度均高达98%以上,且随发酵时间延长,其丰度变化不大;而发酵萝卜丝中厚壁菌门的丰度随发酵时间延长呈上升趋势,由88.30%(20 d萝卜丝)上升到 99.97%(60 d萝卜丝),二者差异极显著(P<0.01)。结果提示,坛子肉与萝卜丝混合发酵环境下,坛子肉可促进萝卜丝中厚壁菌门丰度增加。随发酵时间延长,发酵萝卜丝中蓝藻门(Cyanophyta)的丰度呈下降趋势,由7.47%(20 d萝卜丝)下降到0%(60 d萝卜丝);而发酵坛子肉中蓝藻门的丰度却呈上升趋势,由0.15%(20 d坛子肉)上升到0.45%。结果提示,混合发酵可能促进了蓝藻门由萝卜丝向坛子肉转移,坛子肉中蓝藻门丰度的增加。变形菌门(Proteobacteria)在发酵20 d萝卜丝中的丰度最高,为3.52%,其丰度随着发酵时间延长急剧下降,60 d 萝卜丝中的丰度仅为0.02%;而坛子肉中的变形菌门得丰度呈上升趋势,由0.03%(20 d坛子肉)上升到 0.59%(75 d坛子肉)。结果提示,发酵可能促进了变形菌门由萝卜丝向坛子肉转移,坛子肉中变形菌门丰度的增加。以上结果提示,萝卜丝与坛子肉一起发酵,促进了坛子肉中变形菌门、蓝藻门丰度增加,以及萝卜丝中厚壁菌门丰度增加。最终,坛内细菌群落将趋于平衡,这与UPGMA层次聚类分析及PCoA分析的结果一致。

图4 门水平上各样品细菌群落变化聚类柱状图

由Bray-Curtis距离聚类树可知,20 d坛子肉与60 d萝卜丝、40 d坛子肉与75 d萝卜丝的聚类较近且分支较短,说明其菌群组成较相似。结果提示,发酵早期坛子肉(即20 d坛子肉、40 d坛子肉)的细菌群落与发酵中后期萝卜丝(60 d萝卜丝、75 d萝卜丝)相似,这应该与入坛萝卜丝中丰富的细菌群落及其分泌的高活性酶、坛子肉中丰富的营养成分(蛋白质、糖类、脂肪),陶坛中的残留的活菌(每次发酵结束后,陶坛是不清洗的,继续下一轮的发酵)有关,从而促进了坛子肉在20 d内迅速发酵,细菌群落丰度迅速增加。事实上,坛子肉在发酵的75 d中,发酵前期可能是其微生物迅速增殖、感官品质(色、香、味、形、质)形成的阶段,而发酵后期应该是其后熟的阶段,即坛内细菌群落稳定、坛子肉感官品质进一步完善,特别是风味的进一步提高。关于坛子肉发酵时间、后熟时间的确定,本项目组将进一步做深入研究。

不同发酵时间的坛子肉、萝卜丝中菌群在属水平上的变化如图5所示,细菌群落的相对丰度在属水平上最高的是乳酸杆菌属(Lactobacillus),在不同发酵时间的坛子肉中的丰度均大于99%(P>0.05),然而在20 d萝卜丝中的丰度最低,为92.68%,随着发酵时间延长,萝卜丝中乳酸杆菌属丰度呈上升趋势,75 d 萝卜丝中乳酸杆菌属丰度为99.61%。蓝细菌属(Streptophyta)在不同发酵时间的坛子肉中的丰度均低于1%(P>0.05),且随着发酵时间延长呈上升趋势,而萝卜丝中的丰度呈下降趋势;20 d萝卜丝中丰度最高,为7.61%,75 d萝卜丝中丰度最低,为0。伯克氏菌属(Burkholderia)在20 d萝卜丝中的丰度较高,占样品菌群的2.95%,随着发酵时间延长其丰度降低;伯克氏菌属在坛子肉中的丰度均低于1%,无明显变化规律(P>0.05)。以上结果与细菌群落在门水平上的丰度分析结果一致,即随着发酵时间延长,坛内细菌群落将趋于平衡。此外,不同发酵时间的坛子肉中均未检出杜擀氏菌属(Duganella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、黄色杆菌属(Flavobacterium)、四联球菌属(Tetragenococcus),其中杜擀氏菌属、类芽孢杆菌属、根瘤菌属、紫色杆菌属、黄色杆菌属仅在20 d发酵萝卜丝中检出,其他发酵萝卜丝中均未检出。这可能与坛子肉中的高丰度乳酸杆菌有关,乳酸杆菌能够抑制杂菌生长[17-18],此外,随着萝卜丝中乳酸杆菌丰度的提高,萝卜丝中的杂菌也受到了抑制。

图5 属水平上各样品细菌群落变化聚类柱状图

由Bray-Curtis距离聚类树可知,20 d坛子肉与60 d萝卜丝、40 d坛子肉与75 d萝卜丝的聚类较近且分支较短,说明其菌群组成较相似,此结果与门水平上的 Bray-Curtis距离聚类树结果一致。

细菌物种分类热图是基于不同分类水平的物种丰度表绘制的,并经过Z值转化,将同一个菌的表达丰度进行归一化。从图6可以看出,75 d坛子肉中色彩值大于1的优势菌属的种类最多,有7种,包括棒状杆菌属(Corynebacterium)、丙酸杆菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、β-变形菌属(Betaproteobacteria_unclassified)。60 d坛子肉中色彩值大于1的优势菌属的种类有3种,包括双歧杆菌属、乳酸杆菌属、螺杆菌属。40 d坛子肉中色彩值大于1的优势菌属的种类有2种,包括双歧杆菌属、乳酸杆菌属。20 d坛子肉中色彩值大于1的优势菌属的种类有4种,包括双歧杆菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、四联球菌属。前人报道,乳酸菌属[16]、链球菌属、葡萄球菌属[19]、片球菌属(Micrococcus)和青霉菌属(Penicillium)等是发酵肉制品中的优势菌属[20]。本试验中,双歧杆菌属、乳酸杆菌属在坛子肉发酵的前60 d一直保持着较高的丰度,链球菌属是20 d坛子肉中的优势菌属,葡萄球菌属是75 d坛子肉中的优势菌属[21]。关于双歧杆菌属、乳酸杆菌属在20、40、60 d坛子肉中均为优势菌属,而在75 d坛子肉中不是优势菌属,这与周慧敏等[22]、Essid等[23]、潘晓倩等[24]结果结果一致,即发酵肉中的乳酸菌数量在发酵过程中呈先上升后下降的趋势。

图6 各样品在属水平的热图

棒状杆菌属、丙酸杆菌属、螺杆菌属、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、β-变形菌属是75 d坛子肉的优势菌属,四联球菌属是20 d坛子肉的优势菌属,这与前人报道不同[25],可能与萝卜丝入坛发酵有关。

20 d萝卜丝中的优势菌属的种类最多,60 d萝卜丝中的优势菌属的种类最少,即萝卜丝中的优势菌属的种类随着发酵时间延长先降低后升高。20 d萝卜丝中色彩值大于1的主要优势菌有紫色杆菌属、杜擀氏菌属、黄色杆菌属、类芽孢杆菌属、根瘤菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、伯克氏菌属、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、蓝细菌属;40 d萝卜丝中色彩值大于1的优势菌属有四联球菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属(Helicobacter)、链球菌属(Streptococcus)、根瘤菌属、类芽胞杆菌属(Paenibacillus);60 d萝卜丝中色彩值大于1的优势菌属有乳酸杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium);75 d萝卜丝中色彩值大于1的主要优势菌属有乳酸杆菌属、链球菌属、四联球菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、根瘤菌属、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)。以上结果提示,发酵初期萝卜丝中的微生物群落的种类很丰富,随着发酵时间的延长,萝卜丝中的优势菌群种类减少,并与同一发酵时间节点的坛子肉中优势菌群的种类接近,特别是发酵 60 d 时的优势菌群种类最为接近。另外,丙酸杆菌属、螺杆菌属、假单胞菌属、鞘脂单胞菌属、四联球菌属是发酵萝卜丝中的优势菌属,证实了之前的猜想,即坛子肉中的丙酸杆菌属、螺杆菌属、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、四联球菌属可能与萝卜丝入坛发酵有关。

3 结论

萝卜丝随坛子肉入坛发酵,随发酵时间延长,坛子肉中微生物的丰富度越来越高,多样性增加,均匀度增加,说明萝卜丝入坛发酵促进了坛子肉中微生物的生长繁殖,特别是发酵第60 d的坛子肉及萝卜丝中细菌菌群的丰富度和多样性明显高于其他发酵阶段的样品。另外,坛子肉中的优势菌群主要包括乳酸杆菌属、双歧杆菌、葡萄球菌属、链球菌属、螺杆菌属等,不同发酵时间节点的坛子肉及萝卜丝中的优势菌群种类差异较大,且坛子肉在不同发酵时间的优势菌群与对应发酵时间的萝卜丝的优势菌群差异较大。当发酵时间为60 d时,坛子肉、萝卜丝中的优势菌群均包括乳酸杆菌属、双歧杆菌属,推测60 d发酵时间是坛子肉与萝卜丝中乳酸杆菌属、双歧杆菌属平衡的时间节点。