邓丽嫦 吴声振 邬素珍 洪美华 李聪聪

1.广东省佛山市禅城区中心医院，广东佛山 528000；2.广东省汕尾市食品药品检验所，广东汕尾 516600

健脾利湿和胃膏是医院协定膏方，由党参、当归、陈皮、黄柏、佛手，鸡内金、丹参、薏苡仁、炒白扁豆、白芍、神曲、山药、茯神等二十余味药组成的中药复方膏剂，具有健脾和胃、利湿祛暑、宁心安神、补气行血的功效。本膏方针对现代人生活节奏快、生活工作压力大、饮食不节、缺少锻炼的亚健康状况制定方药，适用于肢体困倦、食欲不振、腹痛、腹胀、便溏、腰膝酸痛、头晕耳鸣、头胀、失眠等证属脾胃虚弱、暑湿内困的亚健康状况人群。为了加强膏方质量控制，根据《中国药典》2015年版四部[1]通则非无菌产品微生物限度检查法（1105微生物计数法、1106控制菌检查法、1107非无菌药品微生物限度标准）的要求，建立了健脾利湿和胃膏的微生物限度检查法并进行了验证，确保膏方微生物检查法的准确性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司），SW-CJ-1F超净工作台（苏州净化设备有限公司），BSC-1300Ⅱ2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），DT300电子天平（常熟市长春仪器仪表厂），DHG-9145H鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 试剂

氯化钠（分析纯），试验中所用培养基购买于广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 样品

健脾利湿和胃膏3批（广东省佛山市禅城区中心 医 院，批 号：20190310、20190420、20190508，规格：50g/瓶）。

2 方法与结果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法验证

2.1.1 菌液制备 取分别于胰酪大豆胨液体培养基30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌液体培养物；取于沙氏葡萄糖液体培养基20～25℃培养5～7d的白色念珠菌新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL≤100cfu的菌悬液。取于沙氏葡萄糖液体培养基20～25℃培养5～7d的取黑曲霉菌的新鲜培养物加入3～5mL 0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子并将菌液稀释至每1mL≤100cfu的菌悬液。

2.1.2 供试液制备 称取10g供试品，加入100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，制成供试液备用（1∶10）。

2.1.3 测定方法 平皿法：平行取四份供试液（1mL/皿），其中2个平皿立即倾注15mL温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基混匀，另2个注入沙氏葡萄糖琼脂培养基摇匀，将以上平皿分别置30～35℃或20～25℃培养，需氧菌培养不超过3d，霉菌及酵母菌培养不超过5d，在3d和5d分别进行计数。

2.1.4 回收比值测定

2.1.4.1 试验组 分别取1∶10的供试液各9mL，分别加入1mL含菌量≤100cfu的上述五种试验菌液，混匀后吸取1mL置平皿中，马上加入15mL胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀。同法制备2个平皿。另取供试液9mL，分别加入白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液1mL混匀后，吸取1mL置平皿中，马上加入15mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。同法制备2个平皿。依2.1.3法培养后做菌落计数。

2.1.4.2 菌液组 取1mL≤100cfu的上述五种菌悬液，分别置平皿中，马上加入15mL胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀。各同法制备2个平皿。另取1mL≤100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液，置平皿中，马上加入15mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。同法制备2个平皿。依2.1.3法培养后测定所加入的试验菌数。

2.1.4.3 供试品对照组 取供试液1mL，注入平皿中，平行四份，其中2个平皿立即倾注15mL温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基混匀，另2个注入沙氏葡萄糖琼脂培养基摇匀。依2.1.3法培养后测定供试品本底菌数。

2.1.5 试验结果 同法用平皿法验证样品三批，见表1。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值试验结果（平皿法）（cfu）

计算公式为：

表1数据表明，供试品各试验菌的回收比值试验均在0.5～2，说明在实验条件下无抑菌现象，符合微生物计数检查验证要求。

2.2 控制菌（大肠埃希菌）计数法验证

2.2.1 菌液制备 取于胰酪大豆胨液体培养基上30～35℃培养18～24h的大肠埃希菌新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成菌悬液（1mL≤100cfu）。

2.2.2 供试液制备 按照2.1.2供试液项下制备。

2.2.3 试验组 取10mL供试液（1∶10）和≤100cfu的大肠埃希菌菌液分别注入胰酪大豆胨液体培养基100mL，混匀后于30～35℃培养18～24h；取1mL上述培养物加入100mL麦康凯液体培养基，混匀后于42～44℃培养24～48h；另划取麦康凯液体培养物于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18～72h。

2.2.4 阳性对照 取≤100cfu大肠埃希菌菌液加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组。

2.2.5 阴性对照 取100mL胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24h；其他同试验组。

2.2.6 试验结果 同法验证三个批次，见表2。

表2数据表明供试品采用常规法控制菌能正常检出，阴性对照未检出，在实验条件下无抑菌现象，符合控制菌检查验证要求。

表2 大肠埃希菌计数法验证结果（常规法）

上述方法验证结果表明健脾利湿和胃膏可按平皿法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查，按常规法进行控制菌（大肠埃希菌）的检查。

3 讨论

2015年版《中国药典》四部的微生物限度检查法进一步完善了2010年版的方法并接轨国际通用标准，保障了微生物角度控制非无菌制剂的安全性和有效性[2]。按照《中国药典》四部的要求，中成药、医院制剂微生物检验方法应该按照药典规定完成方法学验证后进行检验。 严晓明等[3-7]对医院制剂进行了微生物限度检查学的方法验证，赵会兰等[8-14]对中成药进行了微生物限度检查学的方法验证，确保方法的完整性和检验结果的准确性，证明了一厂、一品、一规的药物微生物限度检查法在生产工艺变更、组方成分改变、检查法修订或检验条件发生改变时，也应重新进行方法学的验证[15-16]。

实验数据表明平皿法检查健脾利湿和胃膏的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，6种阳性对照菌的回收比值均在0.5～2；常规法检查控制菌（大肠埃希菌），实验条件下无抑菌作用。因此，可采用平皿法进行健脾利湿和胃膏的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查，常规法进行控制菌（大肠埃希菌）的检查。实验中采用6种阳性对照菌的回收比值试验确保了方法的准确性，方法适宜、操作简单、重现性好，可作为健脾利湿和胃膏的微生物质量控制方法。