甘椿椿 黄金玉 贾 彬 魏晓鹏▲

1.衢州职业技术学院，浙江衢州 324000；2.天津医科大学药学院 天津市市级药学实验教学示范中心，天津 300070

藤梨根为中华猕猴桃（actinidia chinensis planch）的根，为猕猴桃科猕猴桃属植物。临床上以单方或复方用于胃癌[1]、肺癌、卵巢癌、乳房癌[2]、肝癌[3]、直肠癌[4]等癌症以及慢性胃炎[5]、肝炎[6]、慢性前列腺炎[7]等疾病的治疗。现代药理学研究结果表明，藤梨根具有抗肿瘤[8-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]、保护肝脏[15]等作用。在现有的文献报道中对藤梨根抗肿瘤转移方面的研究较少，本实验对藤梨根95%乙醇提取物进行了体外抗MDA-MB-231肿瘤细胞转移活性的筛选，结果显示其具有较强的抗肿瘤转移活性。

1 资料与方法

1.1 仪器

细胞培养箱（37℃，5%CO2，Thermo Fisher Scientific公司）；超净生物工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司）；BIOTEX全自动酶标板分析仪（美国博腾科技公司）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司）；BioDoc凝胶成像系统（美国UVP公司）；垂直电泳仪，电泳槽（美国伯乐公司）；脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；酶标板（Nest公司）；Transwell小室（美国康宁公司）。

1.2 细胞

人乳腺癌细胞MDA-MB-231（中国科学院上海细胞库）。

1.3 试剂与药品

RPMI-1640培养液（碧云天生物技术有限公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyClone）；四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（Bioind）；二甲基亚砜（碧云天生物技术有限公司）；所用试剂均为分析纯。藤梨根药材于2018年7月采自浙江衢州，由衢州瑞草堂医药有限公司汪建刚主任中药师鉴定，标本（B20180720）存放于衢州瑞草堂医药有限公司。

1.4 藤梨根95%乙醇提取物的制备

有机溶解回流提取：称取干燥粉碎的藤梨根药材10kg，加入5倍量95%的乙醇加热回流提取2h，用纱布过滤提取液，如上方法提取共计3次，合并提取液，减压浓缩，65℃真空干燥箱干燥过夜得粉末状样提取物403g。使用时，藤梨根提取物用DMSO溶解成高浓度储备液，用培养液稀释成稀释制得设定浓度。

1.5 MTT法

用0.25%的胰酶消化MDA-MB-231细胞，用培养液（含10% FBS）配成细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μL。置于37℃，5% CO2的孵箱内培养24h，24h后加入不同浓度的藤梨根提取物，继续培养48h。之后每孔加5mg/mL的MTT 15μL，继续孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定490nm处各孔吸光度。抑制率（%）=[1-（加药组OD值/空白组OD值）]×100%。

1.6 划痕实验

取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化液消化后，收集离心，用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度，5×105个/每孔接种于6孔板中；待细胞长至完全融合后，用10μL tip枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS清洗2次，沿划痕边缘等距离间隔做上标记，以便检测；换液后分别用不同浓度藤梨根提取物处理24h；将6孔板置于倒置显微镜下，观察划痕愈合程度并拍照，利用IPPWIN60测量细胞迁移距离，随后进行统计学分析。

1.7 Transwell实验

取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化液消化，收集离心，5×104个/每孔接种于6孔板中，加不同浓度的藤梨根提取物处理24h，用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，1000rpm，离心5min。无血清RPMI-1640重悬细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL。下室加入5ng/mL的EGF，500μL/孔，上室加入不同浓度化合物处理的细胞悬液200μL，将Transwell小室在37℃，5% CO2的孵箱内孵育4h，棉签刮去上层细胞，PBS洗涤2次，4%甲醛溶液固定，苏木精染色，PBS洗涤2次，晾干，显微镜下拍照，统计细胞个数，观察穿过细胞数。

1.8 明胶酶谱法

取对数生长期细胞，计数后接种于6孔板中，每孔中细胞数目相同，置于37℃，5% CO2的孵箱内培养24h，分别加入终浓度为1、10、50μg/mL藤梨根提取物药液（预先用不含血清的RPMI-1640培养基配制）。相同条件下继续培养48h后，收集上清液，测定蛋白浓度（考马斯亮蓝法），稀释至相同蛋白浓度。凝胶制备与电泳分离方法参考文献[16-17]。MMP-9的活性用与对照组比较灰度值的百分比表示。

1.9 统计学处理

所有实验结果数据均用SPSS22.0统计软件进行分析，计量资料以（）表示，采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果

不同浓度藤梨根95%乙醇提取物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞增殖抑制作用如图1，藤梨根95%乙醇提取物浓度为500μg/mL时能够明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖，显示出一定的细胞毒性，在100μg/mL浓度以下没有细胞毒作用，对MDA-MB-231细胞的增殖没有影响，从而确定非细胞毒剂量。

图1 藤梨根提取物对MDA-MB-231细胞增殖的影响

2.2 划痕实验结果

测定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5个浓度藤梨根95%乙醇提取物在非细胞毒剂量下体外对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响。藤梨根提取物能够明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移，并呈一定剂量依赖性，其IC50值为14.222μg/mL。见图2。

图2 藤梨根提取物对MDA-MB-231细胞迁移的影响

2.3 Transwell实验结果

进一步采用Transwell实验，测定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5个浓度藤梨根95%乙醇提取物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的影响。藤梨根95%乙醇提取物能够明显抑制MDA-MB-231细胞的侵袭，并呈一定剂量依赖性，IC50值为16.973μg/mL。见图3。

图3 藤梨根提取物对MDA-MB-231细胞侵袭的影响

2.4 明胶酶谱法实验结果

明胶酶谱法实验测定藤梨根95%乙醇提取物对MDA-MB-231细胞分泌MMP-9活性影响，与空白对照组相比，藤梨根95%乙醇提取物能够显著抑制MDA-MB-231细胞分泌的MMP-9活性，且存在一定的剂量依赖性。见图4。

图4 藤梨根提取物对MDA-MB-231细胞分泌MMP-9活性影响

3 讨论

为了研究藤梨根提取物抗肿瘤转移作用，同时排除由于细胞毒作用对MDA-MB-231细胞的影响，采用MTT实验检测，确定藤梨根95%乙醇提取物非细胞毒剂量，在非细胞毒剂量前提下，测定不同浓度藤梨根95%乙醇提取物对人乳腺癌MDAMB-231细胞迁移、趋化、分泌MMP-9活性的影响。

肿瘤转移指癌细胞从原发肿瘤脱落、迁移、粘附、浸润进入血液或淋巴管，然后外渗二次进入组织的血液循环，并扩散至转移开始的地方[18-19]，涉及多个步骤，是一个十分复杂的过程，其中，肿瘤细胞的迁移和基底膜的降解是非常重要的组成部分。划痕实验结果显示藤梨根95%乙醇提取物能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移，趋化运动能力，这提示了藤梨根提取物能够在肿瘤细胞开始转移的趋化迁移方面发挥抗肿瘤转移作用。

细胞外基质（ECM）主要是由胶原带白、蛋白聚糖、弹性蛋白、和细胞外基质糖蛋白构成的大分子物质，是细胞生存的重要内环境，也是阻止肿瘤转移的第一道生物屏障。基质金属蛋白酶（MMP）是金属离子与细胞外蛋白酶结合而成的肽链内切酶，其主要作用是降解ECM和细胞之间黏着蛋白。肿瘤发生侵袭时，肿瘤细胞与基底膜表面受体结合分泌MMP，破坏肿瘤细胞周围的基质分子，打开阻止肿瘤转移的物理屏障，便于肿瘤细胞向外生长[20]。MMP-9是可溶性MMP家族中的重要一员，可以降解破坏细胞外基质中W、V型胶原蛋白，其与肿瘤的侵袭、转移和血管生成密切相关[21-22]，MMP-9的表达能促进细胞的侵袭与转移[23-24]。明胶酶谱法实验结果表明，藤梨根95%乙醇提取物可降低人乳腺癌MDA-MB-231细胞分泌的MMP-9活性。提示藤梨根提取物通过抑制肿瘤细胞分泌MMP-9发挥抗肿瘤转移作用。

综上所述，藤梨根提取物具有显著的抗肿瘤转移的活性，其作用机制与抑制肿瘤细胞的迁移，趋化运动和侵袭有关。以上研究为中药藤梨根的现代应用提供了实验依据。