李 真 沈 璟

［对外经济贸易大学附属中学（北京市第九十四中学） 北京 100102］

原生质体融合是植物体细胞杂交的第1 步，属于人教版教材高中生物学选修3《细胞工程》中的重要内容。《普通高中生物学课程标准（2017年版）》［1］在概念4“动物细胞工程”的大概念下，要求学生“概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂合细胞”，通过该部分的学习能针对生产或生活的某一需求，在细胞工程中选用恰当的技术和方法提出初步的设想。而教材中未开展这一部分的实验，造成学生仅掌握基本知识，未形成直观的认识，为了使学生深入理解教材内容和相关知识点，并对植物原生质体制备和融合的过程有感性认识，笔者在课下带领兴趣小组进行了前期实验摸索和改进，课上通过改进后的流程，使学生成功观察到原生质体的融合过程。

1 实验材料、酶解时间和PEG 浓度的设定

教材中提到番茄和土豆原生质体融合，本实验希望用生活中常见的蔬菜和开花植物进行探究。在设计前学生通过查阅文献找到酶解液的配方，选择PEG 诱导融合，选择何种实验材料、该酶解液配方是否适用于所选材料的酶解、酶解时间如何掌握，针对这些问题需进行初步探究，具体实验设计与方案详见表1。

表1 设计角度与实验方案

2 实验步骤［2］

1）配制酶解液（10 mL）：称取甘露醇0.72 g，纤维素酶0.1 g，离析酶0.01 g，果胶酶0.01 g，100 mmol／L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）500 μL，55℃加热10 min，冷却至室温加入牛血清蛋白（BSA）0.015 g，100 mmol／L CaCl2800 μL，加水定容至10 mL。

2)配制0.4 mol／L 甘露醇和0.16 mol／L 的CaCl2溶液（pH＝5.8～6.2）和PEG 溶液［20%～40%（w／v）PEG6000，CaCl20.01 mol／L，KH2PO40.00074 mol／L，山梨醇0.1 mol／L］备用。

3）在玻璃平皿上滴加1 mL 左右0.4 mol／L甘露醇溶液，取洗净晾干的新鲜材料，用解剖刀切成细丝状，尽量保证刀口平齐。

4）用尖头镊子夹取细丝轻柔缓慢地放入酶解液中，25℃、60 r／min 培养1～6 h。

5）取出酶解后的原生质体，置于6 cm 一次性塑料平皿盖子上过200 目或100 目筛子。

6）滤液转移至15 mL 离心管中，500 转离心1 min，去上清液，加入1 mL 0.16 mol／L CaCl2溶液，重悬浮原生质体。

7）将2 种原生质体等量混合后，静置10 min。

8）滴入等量的PEG 液，静置15 min 后，显微镜下观察并拍照记录。

3 实验结果与讨论

3.1 不同酶解时间的影响 本研究用纤维素酶、果胶酶和离析酶（具有半纤维素酶和果胶酶活性）配制酶解液，以酶解法制备原生质体。由于小白菜的叶片光滑、平直、无毛，且主叶脉明显，便于操作，所以先尝试使用小白菜作为实验材料探究。切取1 g 小白菜细丝放入10 mL 酶解液中，震荡培养酶解1～6 h 后取出，用5 mL CaCl2溶液重悬原生质体，随后使用血球计数板统计完整的原生质体数量，3 次生物学重复分别计数后求平均值。结果如图1所示，原生质体的数量呈现先升高后降低的变化趋势，酶解1～3 h 后视野下可见的原生质体数量较少，4 h 后视野下可见完整的原生质体数量大幅增加，多达2.2×105个／mL，且大部分原生质体完整性较好呈圆球形，4 h 后随着酶解时间的延长，视野下可见的完整原生质体数量逐渐减少，6 h 时大部分原生质体已破损，呈圆球状完整原生质体的数量大幅降低，可能是由于酶解时间过长，对原生质体造成一定程度的破坏。

图1 不同酶解时间原生质体数量统计

3.2 不同材料的影响 为了获得更多的原生质体同时便于观察融合程度，本研究中共选择具有3种颜色的8 种实验材料，基于小白菜酶解时间的实验结果，分别用250 mL 锥形瓶震荡培养4 h 后显微镜下观察（图2）。钙菜、快菜、生菜、小白菜、油菜、油麦菜原生质体完整性都较好；从数量看，400 倍视野下生菜、小白菜的制备效果显著优于其他材料；从颜色看，小白菜和钙菜的绿色较其他4 种材料略深，这可能与植物的叶片厚度、叶片的形态、细胞的结构有关。除此之外，视野下可见棣棠花（图2G）和紫甘蓝（图2H）在酶解4 h 后原生质体均完整性好、数量满足融合需要。

图2 不同材料酶解4 h 后的原生质体

3.3 不同PEG 浓度的影响 在原生质体融合时，使用不同浓度的PEG 融合效果和处理时间存在较大差异，本实验中使用小白菜和紫甘蓝酶解4 h 后加入不同浓度PEG 诱导15 min。结果显示（图3），20% PEG 诱导15 min，大部分原生质体仅是距离靠近但并未融合，使用30% PEG 诱导开始观察到原生质体的融合，而40% PEG 造成多个原生质体的多聚融合，不利于结果的观察。随着时间的延长，原生质体融合的程度逐渐增加。

图3 不同PEG 浓度下原生质体的融合情况

4 结论

由以上实验结果可知，不同酶解时间、不同实验材料、不同PEG 浓度都会影响原生质体的制备和融合效果。酶解时间4 h 时原生质体数量最多、完整性最好；实验材料选择紫甘蓝、棣棠和小白菜，前二者具有独特的颜色便于观察融合情况，而根据实验结果制备绿色的原生质体选择生菜或小白菜效果较好，但是由于生菜独特的羽状叶，在切取过程中难度大、耗时长，最终选择小白菜制备绿色的原生质体；使用浓度为20%和30%的PEG 都可诱导原生质体的融合，但是低浓度需要的诱导时间较长，高浓度能适当缩短诱导时间。为了提供更多的可选材料，让学生在短时间观察到多种明显的实验结果，同时保证充足的实验准备时间，最终选用小白菜（绿色）、棣棠花（黄色）、紫甘蓝（紫色），酶解4 h 后使用30% PEG 诱导原生质体的融合。

利用显微镜进行观察，学生可直观地观察到不同颜色不同材料的原生质体融合过程（图4），课堂上要求学生用手机拍照并标注使用材料、放大倍数等信息上传到班级群内（图5）。

图4 以紫甘蓝和小白菜为例的原生质体融合

图5 学生拍摄的图片

5 讨论

不同植物酶解时间有较大差异。例如，珠眉海棠根采用两步法酶解需要25℃、40 min［3］；秀珍菇需要30℃酶解3 h［4］；穆惠敏等［5］在28℃情况下，酶解100 min 制备紫菜的原生质体；杜小云等［6］建立“红颜”草莓瞬时转化体系，需要31℃酶解10 h。由于不同植物材料的木质化程度不同，酶解时间从几十分钟到十几小时变化较大。本实验中用不同时间酶解小白菜叶片，4 h 时完整的可后续使用原生质体数量最多，随着时间的延长，原生质体数量逐渐降低，4 h 后细胞已充分酶解，而震荡处理会造成原生质体的损伤，所以酶解时间不宜过长。

珠眉海棠根可采用一步法或两步法酶解，但是两步法效果更优［3］；齐耀程［7］在制备三生烟叶片与烟花的原生质体时，叶片最佳制备条件为1%纤维素酶、0.5%的离析酶、酶解4 h，而烟花最佳制备条件为0.8%纤维素酶、0.4%的离析酶、酶解2 h，可见不同的实验材料影响酶解的条件。在本实验中选用常见菜的叶片为材料，方便获得，叶片当中含有较多的薄壁组织，酶解较其他植物器官容易。

一般所用的PEG 相对分子质量为1 000 ～6 000，PEG 分子量大于1 000 时，才能诱导原生质体达到紧密的粘连和较为理想的融合效果［8］。广藿香原生质体融合时，使用40% PEG6000 化学促融30 min，聚合率可达57.19%［9］；白色金针菇菌株3W4 和白色金针菇菌株FMY1203 为亲本，双亲原生质体使用40% PEG 进行融合处理［10］；康林芝等［11］使用25%PEG4000 将金针菇与平菇融合。本实验中使用的是PEG6000，PEG 的浓度较低或处理时间过短，会导致融合效果不理想；浓度过高或处理时间过长，对原生质体的毒害作用增强，可能造成原生质体的活性丧失或减少异核体的融合率。本实验中40%的PEG6000 处理很可能是由于浓度过高，造成异核体融合率显著降低，而同种植物的原生质体融合程度大幅增高。

6 小结

《普通高中生物学课程标准（2017年版）》［1］对教师的教学和学生的能力提出了更高的要求，教师应该为学生的科学探究和科学思维能力的培养提供更多的机会，生物学科是实验学科，知识的掌握和运用应当从实验中来，到生活中去，真正将看不见摸不到的知识转变成看得见摸得着的实验，让学生体会到生物学科的应用和魅力。本节课是对选修教材的开发和拓展，通过笔者的引导，学生自主开展实验设计，深刻体会到思考在前行动在后的重要性，实验需要想清楚、设计好、再行动；同时在操作过程中学生体会到每一个环节的设计都要严谨，实验结果的获得需要反复验证，实验探究是一个曲折的过程，需要不断的调整、尝试、重复。此外本节课也能很好检验学生对知识的掌握情况，只有辨别出完整原生质体观察到融合的情况，才能拍照上传，完成课上任务。笔者认为这是一节体现生物学学科核心素养、有借鉴价值的实验课。