张 雯， 龙欢欢

(黔南民族师范学院 生物科学与农学院， 贵州 都匀 558000)

生物体发光现象在海洋无脊椎动物中最为常见，这种源于Aequorea victoria多维管束水母中的绿色荧光蛋白(GFP)是主要的发光来源之一。GFP是由238个氨基酸组成的蛋白质，在各种不同的系统中表达后，重组GFP均可吸收蓝光，发出明亮的绿色荧光[1]。报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用其表达产物标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体[2]。GFP作为一种新型的报告基因[3]，具有荧光性质稳定、对细胞无毒性、使用方便、可对活细胞实时定位观察等优点[4]，在生命科学领域被广泛用于研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等生命活动的实时定位观察[5]。因GFP的生物发光不需任何底物或辅助因子，已成为监测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的重要报告基因[6-7]。pET15b-152-GFP与pET15b-3E3-GFP是实验室中最常用的报告基因，对其表达培养最优条件的筛选可为后续的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒提取试剂盒购自Qiagen公司；菌种E. Coli(Top10、B cell、BL21、K12)和重组绿色荧光蛋白质粒(pET15b-152-GFP、pET15b-3E3-GFP)均为黔南民族师范学院生物科学与农学院保存并提供。培养基分别为富集酵母培养基、LB培养基和2×YT培养基，其配方见表1。

表1 试验所用培养基配方 Table 1 Medium formula for experiment

1.2 方法

1．2．1 GFP质粒转化TOP10大肠杆菌 处理1：新鲜感受态TOP10大肠杆菌100 μL+ GFP质粒0.5 μL+不含氨苄青霉素的LB培养液900 μL；处理2(对照)新鲜感受态TOP10大肠杆菌100 μL+灭菌水0.5 μL+不含氨苄青霉素的LB培养液900 μL 。方法：首先试管中加入质粒与大肠杆菌后，轻轻敲打小试管2～3次混合内容物，冰浴10 min，42℃，放置90 s，再冰浴10 min；其次加入不含氨苄青霉素的LB培养液后，摇床中设置37℃、150 r/min震荡1 h，使细菌复苏并表达抗体基因；最后分别取100 μL、900 μL处理1培养液和1 000 μL对照培养液，离心，弃上清液取沉淀，分别加入含有氨苄青霉素的LB琼脂板上(平板底部做好标记)，用玻璃涂布器涂布均匀，30℃、培养16～18 h至单菌落形成。

1．2．2 试剂盒提纯GFP质粒DNA 接种针挑取琼脂板中的单菌落于盛有5 mL LB液体培养基(含100 mg/mL Amp 5μL)的试管中，30℃，300 r/min摇晃培养8 h；取200 μL GFP质粒起始培养液至100 mL LB液体培养基(100 μL，浓度为100 mg/mL Amp)的摇瓶中，37℃，300 r/min摇晃培养16 h。

将菌液全部取出收集在EP管中，4℃，6 000 g离心15 min；弃上清液加入4 mL P1缓冲液降级RNA；加入4 mL P2缓冲液，上下轻轻反转4～6次，打开细胞膜，释放质粒；加入4 mL冷却过的P3缓冲液迅速反转4～6次，碱性中和剂沉淀不需要的物质，冰浴15 min(等待间隙用QBT缓冲液平衡过滤柱便于质粒DNA附于琼脂膜上)。

15 000 g，4℃，离心30 min，取上清液(保留240 μL上清液作纯度检测)，放入已平衡好的过滤柱中重力自然过滤流下(保留240 μL重力流的样液作纯度检测)；加入10 mL QC缓冲液清洗过滤柱去除提纯过程中的污染物，再加入10 mL QC缓冲液清洗过滤柱去除碳水化合物(保留400 μL样液作纯度检测)；加入5 mL QF缓冲液洗脱琼脂膜上的GFP DNA(保留100 μL样液作纯度检测)；加入3.5 mL异丙醇脱水，15 000 g，4℃，离心30 min，弃上清液；加入2 mL 70%乙醇脱盐，15 000 g，4℃，离心10 min，弃上清液，此步骤重复1次；空气中晾干5～10 min，重新溶解于100 μL去离子水中。

1.2.3 菌种的培养与诱导 从-80℃冻存箱中挑取均插入36 ng/mL抗体并转化至大肠杆菌(BL21，B cell，K12)中的新鲜菌种pET15b-152GFP-BL21、pET15b-152GFP-Bcell、pET15b-152GFP-K12、pET15b-3E3GFP-BL21、pET15b-3E3GFP-Bcell、pET15b-3E3GFP-K12与阴性对照菌种pET15b-GFP-BL21、pET15b-GFP-Bcell、pET15b-GFP-K12共9组，接种于含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB固态培养基中，30℃，活化培养16～18 h。挑取菌落划线于含有浓度为100 mg/mL氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG诱导的富集酵母固体培养基上(每组菌种以挑取多菌落到单菌落为原则划3条线并编号为①②③)，30℃，培养16～18 h；用于划线的牙签置于1 mL LB液态培养基中(已标签并含100 mg/mL氨苄青霉素)共27管，置于30℃、180 r/min摇晃培养16～18 h；加0.4 mmol/L IPTG诱导表达，在25℃恒温条件下摇晃培养16～18 h。

1.2.4 pET15b-152GFP-Bcell诱导条件的筛选

1) 固态培养基及培养温度筛选。比较25℃和30℃下pET15b-152GFP-Bcell在2×YT固体培养基、LB固体培养基和富集酵母固态培养基中的绿色荧光表达情况。方法：按挑取多菌落到单菌落为原则，从新鲜活化的培养基中挑取pET15b-152-GFP-Bcell组与阴性对照组pET15b-GFP-Bcell菌落，转接到5 mL含100 mg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，3次重复，于30℃，200 r/min摇晃培养16～18 h。选择生长最好的菌液在固态富集酵母培养基、LB培养基和2×YT培养基中(含100 mg/mL氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG)划线培养，分别于25℃、30℃恒温条件下诱导培养16～18 h，2次重复。

2) 液态培养基及培养温度的筛选。比较25℃和30℃下pET15b-152GFP-Bcell在2×YT液体培养基、LB液体培养基和富集酵母液态培养基中绿色荧光的表达情况。方法：将pET15b-152GFP-Bcell组与pET15b-GFP-Bcell组(阴性对照)扩大培养基中的菌液分别加入5 mL含100 mg/mL氨苄青霉素及0.4 mmol/L IPTG的富集酵母液体培养基、LB液体培养基和2×YT液体培养基中，分别于25℃、30℃ 180 r/min的恒温条件中摇晃诱导培养16～18 h, 2次重复。

3) IPTG浓度梯度培养基的筛选。比较pET15b-152GFP-Bcell在30℃条件下，富集酵母液体培养基中， 0 mmol/L，0.1 mmol/L，0.4 mmol/L，1 mmol/L IPTG浓度诱导的绿色荧光表达效果。方法：将pET15b-152GFP-Bcell菌液组和pET15b-GFP-Bcell对照菌液组分别加入5 mL含有浓度为100 mg/mL氨苄青霉素的富集酵母液体培养基中，于30℃，200 r/min条件下摇晃培养3 h，4次重复。每组菌液分别加入0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.4 mmol/L、1 mmol/L的 IPTG置于30℃，200 r/min，摇晃诱导培养16～18 h；离心，去上清液，蓝光下观察绿色荧光的表达情况。

2 结果与分析

2.1 提取质粒的纯度

经试剂盒中量提纯后的质粒产物经1%琼脂糖凝胶电泳，产生的扩增条带位于对应DNAmarker超6 000 bp处(图1)，与预期6 447 bp的目的基因片段大小相近；对于低复制率的质粒，试剂盒提纯的期待产量在20～100 μg，利用NanoDrop 2000超微量紫外可见分光光度计测量，在100 μL的提纯质粒中其浓度为621.3 ng/μL，即62.13 μg，属于正常值内，其中A260/280=1.83，A260/230=2.21，也表明所提取质粒超纯，所得条带为目的GFP的基因片段。

2.2 不同培养基中重组质粒的绿色荧光表达

2.2.1 固态富集酵母培养基 在固态富集酵母培养基中，宿主细胞为K12表达能效低，无法表达绿色荧光(图2A)；宿主细胞为BL21的固态富集酵母培养基中，pET15b-152GFP-BL21表达绿色荧光能力最强，pET15b-3E3GFP-BL21次之，没有插入抗体的pET15b-GFP-BL21无表达(图2B)；宿主细胞为B cell的固态富集酵母培养基中，只有pET15b-152GFP-Bcell较弱能力的绿色荧光表达，其他重组质粒无荧光表达(图2C)。

2.2.2 液态LB培养基 从图3看出，27只试管菌液在30℃，180 r/min过夜培养后只有12只试管菌液生长，加入0.4 mmol/L IPTG后25℃，180 r/min培养；12只试管菌液中只有pET15b-152GFP-BL21的绿色荧光表达能力最强；为确保观察的精确性，各取1 mL菌液离心，长势好和具有绿色荧光表达能力的菌液蓝光检测仍是重组质粒pET15b-152GFP-BL21表达能力最好。

2.2.3 pET15b-152-GFP-Bcell诱导条件的优化 由于K12宿主细胞表达能力太弱无法表达绿色荧光蛋白，只有在寄主细胞B cell中pET15b-152GFP-Bcell能微弱地表达绿色荧光蛋白，进而寻找表达pET15b-152GFP-Bcell的最优条件。

1) 固态培养基不同温度的绿色荧光显色情况。从图4看出，30℃，1 mmol/L IPTG的条件下培养，各培养基中无绿色荧光表达；25℃，1 mmol/L IPTG的条件下培养，培养基中绿色荧表达光显色程度相同。

2) 液态培养基不同温度的绿色荧光显色情况。从图5看出，30℃和25℃下几种液态培养基中的pET15b-152GFP-Bcell在不同的温度下均可以显色，其中富集酵母培养基与2×YT培养基表达情况较好，由于在培养过程中菌液在富集酵母培养基中的生长速度比在2×YT培养基中的生长速度快，所以判定在液态的富集酵母培养基中表达条件最好。

3)不同浓度IPTG诱导条件下绿色荧光显色情况。从图6看出，在富集酵母液体培养基中分别加入0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.4 mmol/L、1 mmol/L IPTG，30℃诱导条件下，pET15b-152GFP-Bcell在绿色荧光蛋白均能表达绿色荧光，且不同浓度处理间无显著差异。

3 结论与讨论

绿色荧光蛋白基因有其特有的优越性，在微生物生理生化研究中具有原位性、实时性的特点，受到越来越多的关注[8]。绿色荧光示踪法是实验室最常用的科学手段之一，绿色荧光蛋白表达条件的筛选具有高效性与时效性，为使用绿色荧光蛋白追踪细胞功能及动态活动试验奠定了基础。研究表明，pET15b-152GFP-BL21在30℃，1 mmol/L诱导在固态富集酵母培养基条件中显色最显著。已经插入抗体的重组质粒在转化噬菌体时，为了避免低能效大肠杆菌影响菌体的生长，选择高能效大肠杆菌作为宿主细胞。新鲜的菌种经过活化后接种于富集酵母培养基上更利于绿色荧光蛋白的表达。

pET15b-152GFP-BL21在30℃，180 r/min，0.4 mmol/L IPTG在液态LB培养基条件中诱导显色最显著，在加入IPTG诱导前菌液的OD值应达0.9左右。各种低浓度溶液的吸光值定量测定依据是朗伯—比耳定律，浓度过高或过低都会影响测量结果的准确性，菌液OD值为0.943左右时其细菌生物量最佳，此OD值以下菌液稀释，保证了所有待测样品的OD值均在分光光度计可信值之内[9]。

与30℃相比，在25℃表达力最弱的重组质粒pET15b-152GFP-Bcell在1 mmol/L IPTG固体培养基中诱导显色更显著，原因可能是25℃是绿色荧光蛋白基因表达速率的温度适应点。重组大肠杆菌表达外源蛋白常采用二阶段发酵模式，即菌体生长阶段和外源基因表达阶段。在菌体生长阶段，为了较快获得足够的生物量，常选择最适生长温度，而外源基因表达阶段的主要目的是获得大量活性外源蛋白，该阶段温度的确定需考虑外源基因的表达速率及外源蛋白的温度适应性，有时低温诱导可达到酶活的最适温度，温度过高或过低时，酶活性均会有所下降[10]。

在30℃与25℃，180 r/min条件下培养的pET15b-152GFP-B cell在液体培养基中显色无显著差异，由于在固体培养基中找出的依据是25℃可能是绿色荧光蛋白基因的适应点其表达速率最大，为何在25℃下的液体培养基中却看不出显著差异需作进一步的研究。在加入IPTG之前，其中的富集酵母液态培养基中的菌液最先达到0.9的OD值。所以，认定其表现出最好的状态。

pET15b-152-GFP-Bcell在0 mmol/L，0.1 mmol/L，0.4 mmol/L和1 mmol/L IPTG的诱导条件下表达绿色荧光无显著差异，原因可能是由于启动子的泄漏，有待进一步深入研究。