甄振鹏，高裕锋，李硕聪，庞扬海，黄敏兴，余构彬，郭剑雄

（广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所），国家糖业质量监督检验中心，中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心，广东广州510316）

低聚木糖是由2个～7个木糖分子以β-1，4-糖苷键结合而成的直链低聚糖的总称，主要包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖等[1-3]。低聚木糖具有稳定性好、热值低等特性，不易被人体消化酶分解，降低了糖分的有效吸收，避免了食用后血糖明显上升的现象，是糖尿病或肥胖症患者极佳的甜味剂[4]。同时作为超强双歧因子，低聚木糖的双歧因子功能是其他低聚糖的10倍以上，可选择性促进人体肠道双歧杆菌的增殖活性，抑制有害菌生长，改善微生物菌群平衡[5-8]。随着膳食结构的改善，健康意识的提高，低聚木糖因其优越的营养保健功能而备受人们关注。

酸奶是以牛奶为原料，加入蔗糖，经过巴氏杀菌冷却后，再添加有益菌发酵培养而成的奶制品。在酸奶发酵过程中，经特定菌种作用，奶中蛋白质、糖类等被分解为更小的功能性分子，如氨基酸、乳糖、半乳糖等，同时降低了脂肪含量，提升了脂肪酸含量，提升了人体对营养物质的吸收率，因此酸奶在现代膳食结构中占有重要地位。近年来，酸奶产业发展迅猛，产品类型越来越丰富，功能性酸奶应运而生。功能性酸奶是指在酸奶中添加一定量的特殊营养成分或功能性成分，如低聚木糖等益生元物质，进一步提升营养品质的一类酸奶[9-12]。目前功能性酸奶在行业中属于较前沿的产品，品类不多，因此相对应的功能性成分监测方法稍有欠缺，尤其是低聚糖方面的检测方法。多数情况下，检测方法的欠缺往往会导致监管困难，产品质量良莠不齐的现象，因此开发酸奶中低聚木糖检测方法，对健全功能性酸奶的质量监管方法，提高功能性酸奶质量监控力度具有重要意义。

目前，食品中低聚木糖的检测方法有薄层层析色谱法、气相色谱质谱法以及液相色谱法等[13]。薄层层析色谱法一般只作定性检测[14]；气相色谱质谱法需要衍生化前处理[14]，检测耗时长，且不能检测单一组分；液相色谱法是目前最常用的方法，有直接检测法、柱前衍生检测法和硫酸水解间接检测法等[15-20]。高效液相色谱串联质谱法具备定性准确、定量灵敏的优点，因此利用高效液相色谱串联质谱法开发食品中低聚糖的检测方法成为了近年来研究的热点[21-22]。本文将以功能性酸奶为研究对象，优化前处理方法，利用高效液相色谱串联质谱法开发功能性酸奶中木糖和低聚木糖（木二糖～木六糖）的检测方法，并在实际应用中对功能性酸奶和普通酸奶进行低聚木糖检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪（LC-20AD 4000 Q Trap）：美国应用生物系统公司；超纯水器（Milli-Q）：美国密理博公司；振荡器（Multi reax）：德国海道夫公司；电子天平（BSA224S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖标准品：爱尔兰Megazyme公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：美国飞世尔公司；有机相滤膜：广州太玮生物科技有限公司。

试验所用的酸奶样品为市场、网络平台中随机购买的样品，包括功能性酸奶与普通酸奶。

1.2 标准溶液配制

分别精确称取木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖标准品各10 mg于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解定容至刻度，将此混合标准储备液用空白基质提取液逐级稀释，配成低聚木糖标准品浓度为5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L 的混合标准溶液。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Altus UPLC BEH Amide，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流动相A：0.10%氨水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～1 min20% A；1 min～5 min 20%～40% A；5 min～10 min 40% A；10 min～11 min 40%～20% A；11 min～13min 20% A。流速：0.25 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。

1.3.2 质谱条件

电离模式：ESI-；仪器参数：气帘气压力241.1 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压4 500 V，离子源温度550℃，雾化气压力378.9 kPa，辅助加热气压力378.9 kPa；采集模式：多反应监测MRM，具体参数如表1所示。

表1 测定木糖与低聚木糖的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of xylose and xylo-oligosaccharides

1.4 样品处理

称取酸奶样品1 g（精确至0.01 g）于10 mL比色管中，加入90%乙醇水溶液定容至10 mL，涡旋振荡，超声溶解20 min，全部溶液转移于50 mL离心管中，以8 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜后，取滤液进行高效液相色谱串联质谱检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件选择

根据木糖和低聚木糖的结构特点，比较了C18色谱柱、HILIC色谱柱、普通硅胶基质氨基柱和新型杂化颗粒专用氨基柱对木糖与低聚木糖的分离效果。结果表明，采用1.7 μm填料孔径新型杂化颗粒技术专用的氨基柱Altus UPLC BEH Amide，分离效果最好。考虑木糖与低聚木糖在负离子喷雾模式下进行检测，加入一定量氨水，能有效提高离子化效率，以乙腈和0.10%氨水溶液作为流动相，调整流动相比例，在10 min内可以实现6种糖的有效分离，如图1所示。

图1 木糖与低聚木糖（1.0 mg/L）标准溶液的总离子色谱图Fig.1 The ion chromatogram of xylose and xylo-oligosaccharides in 1.0 mg/L of standard solution

质谱条件优化方法：以流动注射直接进样方式下，使用质量浓度1.0 mg/L木糖与低聚木糖标准溶液进行母离子，子离子确认，优化碰撞能量和去簇电压等质谱参数。

2.2 沉淀溶剂的选择与优化

木糖和低聚木糖易溶于水，可使用超纯水作为提取溶剂。但由于酸奶中富含易溶于水的成分，纯水提取对检测造成很大的干扰。特别是酸奶中富含的蛋白质大分子会产生乳化和吸附作用，干扰质谱检测，在前处理过程中必须尽量去除。常见的沉淀蛋白质的方法有有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法等[23]。在样品中分别加入2 mL乙醇、2 mL乙腈、2 mL乙酸铅溶液，比对试验了不同蛋白沉淀剂，对加标回收率的影响，结果表明，以乙醇或乙腈作为沉淀剂的效果优于乙酸铅（图2）。

图2 不同类别沉淀剂提取溶剂的回收率Fig.2 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by extraction solvents with different precipitant

综合考虑溶剂本身的毒性和价格，确定乙醇作为沉淀剂。进一步考察了不同乙醇浓度（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，90%，100%，体积分数）混合溶剂对加标回收率的影响，见图3。

结果如图3所示，使用90%乙醇溶液提取时对低聚木糖的综合加标回收率最优。

图3 不同乙醇浓度（体积分数）提取溶剂的回收率Fig.3 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by different extraction solvents with different ratio of ethanol/water

2.3 方法线性范围和检出限

用 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L 标准工作溶液进样分析，以响应强度的峰面积为纵坐标，以质量浓度作为横坐标，绘制标准系列曲线，木糖与低聚木糖标准曲线的相关系数为0.999 5～0.999 7，线性良好。以3倍和10倍信噪比（S/N）确定方法的检出限和定量限，结果如表2所示，可以满足木糖与低聚木糖痕量分析的需要。

表2 木糖与低聚木糖的回归方程、线性范围、相关系数及检出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of xylose and xylo-oligosaccharides

2.4 回收率和精密度

准确添加木糖与低聚木糖混合标准溶液于空白酸奶样品中，在1.0、2.0、10.0 mg/kg 3个添加水平下做6次重复试验，按方法测定，平均添加回收率在76.5%～88.4%之间，相对标准偏差小于9.8%（见表3），均在允许范围内，符合试验要求。

表3 方法的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of the method（n=6）

2.5 实际样品测试

在市场、网络平台上随机购买了30种酸奶，有功能性酸奶与普通酸奶，按照方法进行检测，见表4。

结果如表4所示，30种酸奶中有10个样品检出木糖，含量为1.35 mg/kg～11.85 mg/kg，但标签并未标注加入木糖；20号样品标签中注明添加了低聚木糖，实际检测结果反映了低聚木糖的实际添加值，也表明该方法可以用于实际样品测试中。

表4 市售酸奶木糖与低聚木糖检测结果Table 4 Detection results of xylose and xylo-oligosaccharides in yogurt

3 结论

通过对前处理方法和色谱质谱条件的优化，建立了酸奶中木糖与低聚木糖的高效液相色谱串联质谱检测方法。该方法检出限在0.12 mg/kg～0.54 mg/kg，定量限在0.40mg/kg～1.80mg/kg，回收率在76.5%～88.4%，相对标准偏差小于9.8%，满足食品检测分析的要求。该方法简易、方便、准确，适用于酸奶中木糖与低聚木糖的定量检测。