李婉，曹文红，*，章超桦，秦小明，郑惠娜，林海生

（1.广东海洋大学深圳研究院，广东深圳518108；2.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

众所周知，海洋食品是人类必需营养物质和生物活性化合物的来源，并且富含生物活性肽。小分子肽易被吸收，这些肽在人体中调节生物效应。从海洋生物中提取的生物活性肽具有药理作用。与合成药物相比，这些活性肽被认为更温和、更安全，没有副作用。近年来，各种蛋白肽受到广泛关注，这些小肽具有一定的人体代谢和生理调节功能，可以在肠道内直接被吸收，吸收速度要比游离氨基酸和蛋白质快 2倍～3倍，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，是开发功能食品的新资源[1]。

牡蛎是世界第一大养殖贝类，也是我国养殖产量最大的经济贝类，且产量居全球首位。牡蛎中含有丰富的蛋白质，素有海洋牛奶的美誉。据世界粮农组织评定，牡蛎肉中必需氨基酸完全程度和质量优于牛乳和人乳。牡蛎在《本草纲目》中早有记载：“化痰软坚，清热除湿，止心脾气痛，痢下赤白浊，消庙瘾积块，瘦疾结核”等。牡蛎作为海洋丰富的天然活性肽资源库，目前已发现牡蛎肽具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、改善记忆、血管紧张素转换酶抑制剂、抑菌、解酒护肝、免疫调节[2-6]等生物活性。同时，牡蛎也是一种药食同源的食品，利用其这一特点开发各种保健和功能性食品已成为牡蛎加工利用的主要方向。

国内外关于牡蛎的加工利用有很多，主要集中片剂、胶囊、口服液等营养功能性产品。关于牡蛎肽饮料方面的产品几乎没有，本研究在课题组前期对牡蛎肉营养成分[7]、酶解[8]、脱色[9]、脱腥[10]、风味成分[11-12]及生物活性[13-14]等研究基础上，以牡蛎肽为原料，通过正交和响应面优化试验研制两款风味宜人的果味牡蛎肽营养保健饮料。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

香港牡蛎：湛江市东风市场；风味蛋白酶（18万U/g）：广西南宁庞博生物工程有限公司；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose，CMC-Na）：上海申光食用化学品有限公司；粉末活性炭、颗粒活性炭：佛山市巴珊环保化工有限公司；硅藻土：济南鑫龙晟生物科技有限公司；果胶：广东新如荣生物科技有限公司；蔗糖：湛江冬源食品有限公司；三氯蔗糖：盐城捷康三氯蔗糖制造有限公司；甜菊糖苷：广州市凯文食品发展有限公司；罗汉果粉：上海今良食品技术有限公司；姜粉：亳州宝丰生物科技有限公司；水蜜桃粉：西安福瑞德食品饮料有限公司；薄荷香精：嘉兴大好家食品科技有限公司；椰浆粉：海南南派实业有限公司。

1.2 试验仪器

UV757紫外可见分光光度计、PHS-2F pH计：上海精密科学仪器有限公司；电子分析天平：上海天平仪器厂；Sigma 3k15离心机：德国希格玛离心机有限公司；GZX数显不锈钢鼓风干燥箱：上海启威电子有限公司；SHZ-B型恒温水浴振荡器：江苏金坛市佳美仪器有限公司；HHT4-LX-C50L型立式压力蒸汽灭菌器：北京中西远大科技有限公司；MultiskanFC型酶标仪：美国Thermo公司；JM-50胶体磨：上海贝工泵业制造有限公司；VAPODEST450全自动凯氏定氮仪：德国Gerhardt公司。

1.3 分析方法

蛋白质含量的检测：按照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定；总糖含量测定：按照GB/T 9695.31-2008《肉制品总糖含量测定》中分光光度法测定；水解氨基酸的测定：GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪测定；菌落总数测定：GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群测定：GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》；其他致病菌的测定：GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》。

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

清香型牡蛎肽饮料工艺流程：牡蛎肽粉→脱腥→过滤→调配→稳定剂→均质→灌装→杀菌→冷却→成品→感官、理化评定

椰香型牡蛎肽饮料工艺流程：牡蛎肽粉→脱色→离心→过滤→调配→稳定剂→调节pH值→均质→灌装→杀菌→冷却→成品→感官、理化评定

1.4.2 操作要点

牡蛎肽粉：牡蛎肉按参考文献[15]进行酶解，酶解液经5 kDa超滤膜过滤后浓缩，最终喷雾干燥得到牡蛎肽粉。其酸溶蛋白含量55.91%，游离氨基酸含量7.30%，肽含量51.48%，水分含量为5.56%，分子量＜3 000 Da占99.7%。

调配：清香型牡蛎肽饮料将牡蛎肽、水蜜桃粉、蔗糖，甜菊糖苷，薄荷香精按正交试验所得的最佳比例调配均匀；椰香型牡蛎肽饮料将牡蛎肽、椰浆粉、蔗糖、甜菊糖苷按响应面试验所得最佳比例调配均匀。

脱腥：清香型牡蛎肽饮料使用姜粉和罗汉果粉进行单因素试验，对牡蛎肽进行脱腥。

脱色：椰香型牡蛎肽饮料选择颗粒活性炭、粉末活性炭和硅藻土进行单因素试验，取100 mL上清液，加入脱色剂，40℃下磁力搅拌40 min，脱色完成后4℃下4 000 r/min离心20 min，得到上清液。上清液进行抽滤，得到脱色液。最后计算脱色率、氮损失率。

按下列公式计算脱色率：

式中：A1为脱色前的吸光度值；A2为脱色后的吸光度值。

采用二喹啉甲酸法蛋白浓度定量试剂盒分别测定脱色前后牡蛎多肽溶液中多肽含量，按下列公式计算：

式中：m1为脱色前多肽的含量，g；m2为脱色后多肽的含量，g。

稳定剂：选择CMC-Na和果胶进行正交试验，取10 mL饮料，经过3 000 r/min离心10 min，在660 nm处测定其离心前后的吸光度，计算其悬浮稳定性。悬浮稳定性计算公式如下：

式中：A1为离心后吸光度；A2为离心前吸光度。

1.4.3 感官评价

采用100分制，随机请10位师生（5男5女）对两款果香型牡蛎肽饮料进行感官评价，每项进行评定打分，指标体系和内容见表1。

表1 牡蛎肽饮料感官分析评定标准Table 1 Standard for sensory analysis and evaluation of oyster peptide beverage

1.4.4 最佳配方的确定

1.4.4.1 清香型牡蛎肽饮料

牡蛎肽饮料采用单因素试验所确定的蔗糖添加量，甜菊糖苷添加量，水蜜桃添加量和薄荷香精添加量为4因素，以牡蛎肽饮料感官评分为指标，根据各因素的不同配比对牡蛎肽饮料的感官评定结果进行L9（34）正交试验，确定清香型牡蛎肽饮料的最佳配方，因素水平表见表2。

表2 清香型牡蛎肽饮料配方L9（34）正交优化试验的因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal optimum test L9（34）for refreshing fragrance oyster peptide beverage formula

1.4.4.2 椰香型牡蛎肽饮料

使用Design-expert 8.0软件进行响应面设计，在前期单因素试验探索的基础上选取各因素的适宜条件范围作为设计范围，结果见表3。

表3 椰香型牡蛎肽饮料配方响应面优化设计的因素和水平Table 3 Factors and level of response surface optimization design of coconut-flavored oyster peptide beverage formula

2 结果与分析

2.1 牡蛎肽的脱色

采用粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土3种脱色剂对牡蛎肽进行脱色的结果如图1所示。

由图1可知，在脱色剂用量、时间、温度等条件一致时，粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土3种脱色剂对牡蛎肽都有一定的脱色效果。其中，粉末活性炭脱色率最高，硅藻土的脱色率最低；同时，3种脱色剂的多肽回收率相差不大，均达到90%以上。因此，本研究选用粉末活性炭作为脱色剂，根据参考文献[12]稍作改进得到脱色最佳条件为：粉末活性炭添加量为1.5 g/100 mL，40℃下磁力搅拌脱色40 min，离心取上清液抽滤，脱色率为54.59%，多肽回收率为85.28%。

图1 不同脱色剂对牡蛎肽脱色效果的影响Fig.1 Influence of different bleaching agent on decoloring of the oyster peptide

粉末活性炭比表面积大，能吸附分子直径小的有色物质，从而起到脱色作用[16]。其具有高效能、快速吸附蛋白质酶解液中的色素的作用，同时也具有一定的脱腥作用。

2.2 牡蛎肽的脱腥

对牡蛎肽进行脱腥处理，以姜粉和罗汉果粉进行单因素试验，以感官值为评价指标，结果如表4所示。

表4 姜粉和罗汉果粉的感官评价Table 4 Sensory evaluation of ginger powder and grosvenor powder

由表4可知，牡蛎肽溶液中添加0.05%的罗汉果粉的脱腥效果优于其他组分，其能够有效去除腥味且具有罗汉果的清香，故使用0.05%的罗汉果对清香型牡蛎肽饮料进行脱腥处理。

罗汉果是我国卫生部和中医药管理局批准的第1批药食同源植物，同时其也作为最佳的天然甜味剂被广泛应用[17]。罗汉果的营养价值主要包括医药价值和食疗价值。医药价值主要有润肠肺、止咳、缓解便秘，同时还具有加强抵抗力、抗氧化、保肝、预防致龋、糖尿病治疗、抗菌、抗肿瘤和抗疲劳等新型药学作用[18]。罗汉果的食疗价值依附于其药理功能，具体表现为罗汉果味甘、归肺，通过煎汤，沸水浸泡食用，可缓解肺热咳嗽、咽喉痛或失音、大便秘结等症状。综上所述，罗汉果粉在清香型牡蛎肽饮料中不仅具有脱腥效果，同时还作为天然甜味剂和生物活性因子。

2.3 牡蛎肽饮料稳定剂的确定

复合蛋白饮料的稳定机理较为复杂，影响因素较多，如：胶体颗粒的总位能、沉降速度、pH值、电解质、增稠剂和稳定剂等。CMC-Na是一种纤维素衍生物，也是最主要的离子型纤维素胶，具有黏合、增稠等作用，广泛应用于食品加工中。CMC-Na可与某些蛋白质发生溶胶作用，从而提高蛋白质的溶解度。添加食用CMC-Na能降低食品生产成本，改善口感，延长保质期[19-20]。果胶属于天然食物，是一种安全无毒的天然食品添加剂，无每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）限制。其也具有很多功能，如胶凝剂、稳定剂、组织形成剂、乳化剂和增稠剂，并广泛应用于食品工业中；果胶也是一种水溶性的膳食纤维，具有增强胃肠蠕动，促进营养吸收的功能，对防治腹泻、肠癌、糖尿病、肥胖症等病症有较好的疗效，是一种优良的药物制剂基质[21]。目前，在国内药品和保健品中已有使用果胶的产品。

将CMC-Na与果胶进行正交试验，以悬浮稳定性为评价指标，结果见表5。

表5 牡蛎肽饮料稳定剂配方正交试验优化表L9（34）Table 5 Optimum formula of oyster peptide beverage stabilizer by an orthogonal test of L9（34）

由表5可知，复合型稳定剂加入饮料后提高了饮料的稳定性，黏度也得到一定程度的加强，改善了饮料的口感。但加入的量过多反而影响饮料的色泽，并带来一定量的沉淀，影响品质。因此，最佳复合型稳定剂的添加量分别为CMC-Na 0.05%、果胶0.01%。

2.4 清香型牡蛎肽饮料最佳配方确定

通过正交试验，由10位师生（5男5女）对产品进行感官评价，得出综合平均感官得分，并通过极差分析，得出各因素对试验结果的影响大小顺序为A>D>B>C，见表 6。

表6 清香型牡蛎肽饮料配方L9（34）正交试验水平表Table 6Design of L9（34）orthogonal test on formula of refreshing fragrance oyster peptide beverage

清香型牡蛎肽饮料各因素添加量最佳组合为A3B2C3D3，即：蔗糖7.0%、甜菊糖苷0.8%、水蜜桃粉2.0%和薄荷香精0.2%。为了验证方案的准确性，在此条件下进行验证试验，其感官评价值为82.0，优于各试验组，因此A3B2C3D3组合为最佳配方。最终得出清香型牡蛎肽饮料的配方为牡蛎肽粉3%，蔗糖7%，甜菊糖苷0.8%，三氯蔗糖0.006%，水蜜桃粉2%，罗汉果粉0.05%，薄荷香精0.2%，CMC-Na 0.05%，果胶0.01%。

2.5 椰香型牡蛎肽饮料最佳配方确定

2.5.1 单因素试验

牡蛎肽分别加入椰浆粉（5%、10%、15%）、豆粉（5%、10%、15%）、奶粉（5%、10%、15%）、杏仁粉（5%、10%、15%）、植脂末（5%、10%、15%）和米汤水进行单因素试验，发现加入椰浆粉的组别其色泽最佳，呈乳白色，且风味良好，无异味，有椰子清香。故选择椰浆粉作为椰香型牡蛎肽饮料的辅料。

2.5.2 响应面优化试验

根据单因素试验结果，以牡蛎肽（A）、蔗糖（B）、甜菊糖苷（C）椰浆粉（D）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Benhken试验设计及结果见表7和表8。采用Design-expert 8.0软件对表8数据进行二次回归方程拟合，得到感官评分（Y）对牡蛎肽（A）、蔗糖（B）、甜菊糖苷（C）及椰浆粉（D）的二次多项回归方程：

Y=78.00-1.22A+2.96B-3.98C+0.24D+0.25AB+198AC+1.86AD+10.63BC-16.75BD-2.33CD-1.15A2-14.16B2-0.98C2-12.26D2

表7 椰香型牡蛎肽饮料配方Box-Benhken试验设计及结果Table 7 Box-Benhken test design and results of coconut-flavored oyster peptide beverage formula

表8 回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of the regression model

由表 8 可知，P=0.003 0＜0.01，表明模型极显著，F=16.48，表明模型显著。回归模型的决定系数R2=0.98，Adj R2=0.92，说明该模型能够较好地描述试验结果。

2.5.3 各因素响应面交互作用分析

采用Design Expert 8.0软件对影响椰香型牡蛎肽饮料的4个因素进行交互分析，结果见表8和图2。

图2 牡蛎肽、蔗糖、甜菊糖苷和椰浆粉交互因子的相互作用对感官值的响应面图Fig.2 The interaction of oyster peptide,sucrose,steviol glycoside and coconut cream powder to the response surface of sensory value

由表8和图2可知，牡蛎肽、蔗糖、甜菊糖苷和椰浆粉对椰香型牡蛎肽饮料感官分值的影响趋势为具有最高点的抛物线和上升的圆滑曲面。

2.5.4 最佳配方

采用Design Expert 8.0软件的最优化功能设定因变量感官分值的变化范围，从随机组合开始最陡爬坡试验，直到目标响应值。对预测配方进行验证并根据实际感官评分稍作调整，最终得到椰香型牡蛎肽饮料配方：牡蛎肽3%，蔗糖5%，甜菊糖苷0.48%，椰浆粉10%，三氯蔗糖0.006%，CMC-Na 0.05%，果胶0.01%。

2.6 牡蛎肽饮料品质评价

2.6.1 感官指标

清香型牡蛎肽饮料晶莹透亮，成柔和的金黄色，无腥味有淡淡的清香，外观澄清，无沉淀，滋味纯正，酸甜适中，口感柔和细腻；椰香型牡蛎肽饮料色泽乳白均一，无腥味，具有椰香，甜度适中，口感细腻，无后味。

2.6.2 理化指标

牡蛎肽饮料清香型和椰香型总糖含量分别为6.5 g/100mL、7.3 g/100mL，其蛋白质含量 1.53 g/100 mL和3 g/100 mL。牡蛎肽饮料氨基酸组成分析如表9所示，牡蛎肽饮料清香型和椰香型水解氨基酸含量分别为1.09%、1.65%。清香型牡蛎肽饮料中必需氨基酸/总氨基酸（essential amino acid/total amino acids，EAA/TAA）为37.62%，略低于蛋白质理想模式（EAA/TAA≈40%），必需氨基酸/非必需氨基酸（essential amino acid/nonessential amino acid,EAA/NEAA）为67.69%高于蛋白质理想模式（EAA/NEAA≥60%）；椰香型牡蛎肽饮料中 EAA/TAA为78.79%，EAA/NEAA为 371.43%，这两个比值明显高于联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的理想蛋白质模式，说明椰香型牡蛎肽饮料比清香型牡蛎肽饮料更符合蛋白质理想模式。这两款果香型牡蛎肽饮料氨基酸含量丰富、种类齐全，氨基酸比例较均衡，具有较好的开发前景。

对贝类滋味影响较大的呈味氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸[22]。牡蛎肽饮料呈味氨基酸含量较高，清香型和椰香型分别为：50.46%、49.09%。谷氨酸、天冬氨酸为呈鲜味的特征性氨基酸[23]，在清香型和椰香型牡蛎肽中含量较高，清香型为0.12%和0.16%，椰香型为0.14%和0.32%。支链氨基酸是主要的供能氨基酸，其氧化供能约占氨基酸供能总量的60%[24]。有研究表明支链氨基酸有助于消除疲劳，提高运动能力及加速肌肉合成[25-27]。同时，其还具有调节泌乳[28]和蛋白质代谢[29]、免疫调节[30]等生物活性。清香型和椰香型牡蛎肽饮料支链氨基酸含量分别为18.35%和20.61%。牡蛎肽饮料的氨基酸组成分析见表9。

表9 牡蛎肽饮料的氨基酸组成分析Table 9 Amino acid composition of the oyster peptide beverages%

2.6.3 微生物指标

牡蛎饮料清香型和椰香型的菌落总数分别为＜1 CFU/mL和60CFU/mL，大肠菌群含量均＜0.3MPN/mL，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌未检出，符合GB 7101-2015《食品安全国家标准饮料》和GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》中饮料的微生物和致病菌限量标准。

3 结论

本研究以牡蛎肽为原料，通过脱色、脱腥、调配、均质等工艺调配两款果香型营养保健饮料。清香型牡蛎肽饮料通过正交试验确定了其最优配方，牡蛎肽3%，蔗糖7%，甜菊糖苷0.8%，三氯蔗糖0.006%，水蜜桃粉2%，罗汉果粉0.05%，薄荷香精0.2%，CMC-Na 0.05%，果胶0.01%，其颜色澄清透明，呈金黄色，无腥味，有水蜜桃清香味，清凉苏爽，口感丝滑。椰香型牡蛎肽饮料利用响应面优化其工艺参数，通过验证后得到最优配方：牡蛎肽3%，蔗糖5%，甜菊糖苷0.48%，椰浆粉10%，三氯蔗糖0.006%，CMC-Na 0.05%，果胶0.01%，其颜色呈乳白色，无沉淀，具有椰香味，口感细腻且风味良好，无腥味。