苗雨露，张雯霞，张文智，冯 敏，李媛媛，倪 艳*

（1.山西省中医药研究院，山西 太原 030045；2.山西中医药大学，山西 太原 030619）

还阳参为菊科植物还阳参属屠还阳参Crepis crocea（Lamk）Babc 的干燥全草，最早收载于 《内蒙古中草药》，其味苦，性微寒，有益气、止咳平喘、清热解毒之功效，主产于山西、内蒙古等北部地区，别名为 “驴打滚儿草”“屠还阳参”等［1］。其使用历史悠久，现已被《山西省中药材中药饮片标准》收录。民间常用还阳参煎汤医治喘息性慢性支气管炎、无名肿毒等，治疗效果明显。本课题组从1998 年开始对还阳参进行资源调查，并用科学的方法研究其药理作用和化学成分，以期阐明其安全性和有效性。课题组针对还阳参药理作用及化学成分进行研究，并确认其止咳平喘、益气作用的活性物质。药效实验结果表明，还阳参醇提物石油醚部位通过减少小鼠咳嗽次数、延长小鼠咳嗽潜伏期发挥止咳作用［2］，正丁醇部位通过抑制组胺和乙酰胆碱对豚鼠引起的哮喘发挥平喘作用［3］。除此之外，还研究了还阳参止咳平喘药效物质基础，且从其活性部位分离出一些化学成分，均为首次从中分离得到［4］。《山西省中药材中药饮片标准》中以绿原酸的含有量（不少于0.06%）作为质控标准［5］。

UPLC 指纹图谱能较全面地得到中药中的化学成分的相对含有量，更好地评价药材质量［6-13］。其作为中药研究领域使用较多且较有效的手段之一，该方法操作简便、稳定、应用便捷。本实验建立还阳参UPLC 指纹图谱，结合化学计量学综合评价还阳参药材，以期找到指标成分，建立更合理的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290 infinity Ⅱ高效液相色谱仪、Agilent G4 212 A DAD 检测器、ChemStation 色谱数据工作站（美国Agilent 公司）；FW-100 型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；LC-300B 型数控超声波清洗机（山东济宁鲁超声设备有限公司）；SE402F 奥豪斯型电子分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。

1.2 试药 样品信息见表1，经山西省中医药研究院倪艳教授鉴定为菊科植物屠还阳参Crepis crocea（Lamk）Babc的干燥全草。绿原酸对照品（批号110753-201314，含有量大于98%）、咖啡酸对照品（批号110885-200102，含有量大于98%）均购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈（色谱纯，西陇科学股份有限公司）；甲酸（分析纯，批号20030602，北京北化精细化学品有限责任公司）；水为超纯水。

表1 样品信息

2 方法

2.1 色谱条件 Zorbax SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～10% A；20～30 min，10%～20% A；30～40 min，20%～50% A；40～41 min，50%～5% A；41～45 min，5%A）；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL；检测波长329 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸、咖啡酸对照品，加入甲醇制备成含绿原酸 0.125 1 mg/mL、咖啡酸0.141 2 mg/mL的对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取还阳参药材粉末（过5 号筛）1.5 g，加70% 甲醇15 mL，超声（300 W、40 kHz）提取30 min，静置冷却，再用70%甲醇补足减失质量，过滤，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取还阳参药材（S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，测得各色谱峰相对保留时间和峰面积RSD 均小于0.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取还阳参药材（S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得各色谱峰相对保留时间和峰面积RSD 均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取还阳参药材（S1）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得各峰的相对保留时间和峰面积的RSD 均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立

2.4.1 指纹图谱建立 绿原酸和咖啡酸对照品按“2.2.1”项下方法制备对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，得到绿原酸和咖啡酸对照品液相色谱图，见图1。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，得色谱图，将10 批样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2008A 版），S6 为参照图谱，采用中位数、时间窗为0.2 的方法，得到10 批样品指纹图谱见图2，及对照指纹图谱，见图3，确定18 个共有峰。

图2 10 批样品UPLC 指纹图谱

图3 还阳参对照指纹图谱

2.4.2 相似度分析 通过与对照品溶液色谱图比对，确认5 号峰为绿原酸，6 号峰为咖啡酸。因5 号峰在各样品中均存在，且含有量较高，分离度较好，故选取其为参照峰（S），计算得到18 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积见表2～3。采用“色谱指纹图谱相似度评价系统2008A 版”软件计算10 批样品和对照指纹图谱之间的相似度，分别为0.970、0.996、0.996、0.995、0.996、0.997、0.998、0.998、0.998、0.988，均在0.970 以上，表明10批还阳参质量相对稳定。

2.5 化学计量学分析 相似度评价难以看出10 批药材之间的差异，需要进一步采用聚类分析和主成分分析明确药材的差异，更好的评价10 批还阳参药材质量。

2.5.1 聚类分析 将10 批样品18 个共有峰面积导入SPSS23.0 版软件，然后标准化处理进行聚类分析，得到10×18阶数据矩阵，以组间平均链锁距离及欧氏距离平方作为样品测度。结果见图4。

表2 10 批样品共有峰相对保留时间

表3 10 批样品共有峰相对峰面积

结果显示，当判别条件距离为15 时，10 批样品被分为4 大类，第1 类包括S2、S3、S4、S5、S7、S8；第2 类包括S9、S10；第3 类包括S6；第4 类包括S1。当判别条件距离为20 时，10 批样品被分为2 大类，1 类包括S1；剩下的为另1 类。结果表明，分类情况与产地无关，可能是由于化学成分含有量差异导致。结果与相似度分析结果基本一致。

2.5.2 主成分分析 将18 个共有峰峰面积导入SPSS 23.0软件，然后对其进行标准化处理，将处理后的共有峰峰面积进行主成分分析，相关矩阵的特征值及其方差见表4，结果见图5～6，前4 个主成分的累计方差贡献率为89.614%。

表4 主成分的初始特征值和累积贡献率

图4 10 批样品聚类树状图

由表5 可得，中药化学成分众多，多成分相互作用才是影响还阳参药材质量差异的重要原因。4、7、11、12、15、17 号色谱峰对第一主成分的作用在0.7 以上，是影响第一主成分的主要来源；1、2、9、10、14 号色谱峰对第二主成分的作用在0.7 以上，是影响第二主成分的主要来源；5、8 号色谱峰对第三主成分的作用在0.8 以上，是影响第三主成分的主要来源；第4 主成分主要来自色谱峰10 的信息。

表5 初始因子载荷矩阵

将10 批还阳参药材中18 个共有峰的峰面积导入SIMCA-P13.0 统计软件进行PCA 分析，得到PCA 得分图（图5）、各成分柱状图（图6）。

图5 可直观看到10 批还阳参药材质量的差异，药材1与其他样本距离较远，3、4、5 距离较近，6、7、8 距离较近，分类结果与HCA 结果基本一致。PCA 结果与HCA 的结果可以相互验证。

图6 代表各个色谱峰对还阳参药材质量差异的贡献值，其中9 号峰贡献值最大、依次类推2、14、10、6、5 号色谱峰贡献值较大。可以认为这6 个色谱峰是影响还阳参药材质量差异的主要色谱峰，经对照品指认，5、6 号峰分别为绿原酸和咖啡酸，剩余色谱峰还需结合核磁、液质联用等技术手段进一步鉴别确认。

图5 10 批样品主成分分析图

图6 各成分柱状图

3 讨论

3.1 提取方法和色谱条件考察 参考文献［14］，本实验对提取溶剂、提取方法、提取次数及提取时间进行考察，以色谱峰数目、分离度、基线平稳程度为主要考虑因素，发现70%甲醇超声提取30 min，提取1 次，提取率较好，杂质干扰少。

考察了流动相乙腈、甲醇、0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸，柱温25、26、27、28、29、30 ℃，波 长210、254、329 nm，最终确定“2.1”项下条件，此条件下基线平稳，色谱峰出峰时间合适，色谱峰个数较多，分离效果较好。

3.2 指纹图谱建立 建立了10 批样品UPLC 指纹图谱，共标定了18 个共有峰，以对照指纹图谱为参照，计算相似度，结果显示10 批还阳参药材相似度均大于0.970，表明10 批样品质量相对稳定。且共有峰保留时间相差较小，但峰面积相差较大，表明不同批还阳参化学成分含有量差异较大［15-16］。

3.3 化学模式识别 以5 号峰绿原酸为参照峰，对其进行标准化处理，进行聚类分析和主成分分析。当判别条件距离为20 时，10 批样品被分为2 类，结果表明，分类情况与产地无关，可能是由于化学成分含有量差异导致。主成分分析图显示S1 与其他批次样品相距较远，图6 显示，影响还阳参药材质量差异的主要有6 个色谱峰。聚类分析、主成分分析及相似度结果基本一致，表明本实验建立的还阳参药材指纹图谱具有可靠性。

本实验首次建立了还阳参UPLC 指纹图谱，较全面地反映了还阳参药材化学成分的数目和含有量情况。结合相似度评价、聚类分析和主成分分析共同区分10 批样品，综合评价其指纹图谱，试图找到影响其质量差异的指标成分，为建立更加合理的还阳参质量标准提供科学依据。