曹冠华 ，张 雪，陈 迪，李 莉，张兆传，顾 雯，王希付，贺 森*

（1.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；2.云南大学，云南省生物资源开发与利用国家重点实验室，云南 昆明 650591；3.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院中药资源中心，北京 100700）

三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen，又名田七、参三七，为五加科人参属多年生草本植物，是我国传统的名贵中草药，主要以根部入药，具有止血、散瘀、消肿、定痛等功效，可用于治疗心脑血管、中枢神经系统、代谢系统等疾病［1-2］。

近年来调查显示，三七药材砷、铅超标问题严重，且主要污染途径为土壤污染。阎秀兰［3］、张文斌等［4］对文山州及外延区三七主要种植地土壤样本进行分析，发现总砷质量浓度分别为6.9～242.0、8.38～81.34 mg/kg，远超土壤三级标准As 要求（≤30 mg/kg）；祖艳群等［5］调查发现，文山主要三七种植区中土壤Pb 含有量平均为55.56%，超标率为6.67%。三七重金属超标已成为三七种植业急需解决的问题之一。

植物内生真菌在促进宿主生长、增强胁迫抗性等方面发挥着重要作用［6-8］。内生真菌主要包括不可纯培养的丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）和可纯培养的深色有隔内生真菌（dark septate endophytes，DSE）两大类。目前对三七内生真菌功能的研究较少，张玉洁等［9］对108 株三七内生真菌进行病原菌抑菌效果测试，筛选得到14 株效果菌；刘凯［10］、杨芳芳［11］对三七源内生真菌次生代谢产物及抗菌活性进行研究。本实验拟对分离自三七根27 株内生真菌行重金属（As、Pb）耐性评价，并采用分子手段对功能菌株进行分类学地位鉴定，以期为三七种植As、Pb 污染的生态治理提供数据支持和理论依据。

1 材料

本实验所用菌株为实验室前期分离自3 年生健康三七须根内生真菌，共27 株，编号Pn-1～Pn-27。

2 方法

2.1 菌株重金属耐性评价

2.1.1 耐性菌株初筛 将27 株处于生长对数期的三七内生真菌，用打孔器沿菌落外缘部位打孔取样，取4 片分别接种至终质量浓度为400 mg/L As5+或200 mg/L Pb2+MMN培养基［葡萄糖15 g、MgSO40.15 g、NaCl 0.025 g、CaCl20.05 g、1% FeCl31.2 mL、KH2PO40.5 g、（NH4）2HPO40.25 g、Vitamin B1 100 μg，加纯净水至1 000 mL，调整pH至5.8，121 ℃、20 min 高温高压灭菌］中；30 ℃，120 r/min摇床培养7 d；抽滤，0.01% EDTA 清洗3～4 次，纯净水冲洗5～6 次；45 ℃烘干，称定质量［12-13］。

2.1.2 目标菌株重金属耐性评价 设置砷质量浓度梯度为0、200、400、800、1 600 mg/L；铅质量浓度梯度为0、100、200、400、800 mg/L；按上述接种方式进行接种和处理，称定菌丝干重，并测定菌丝重金属含有量。

2.1.3 砷测定 采用氢化物发生原子荧光光谱法进行测定，具体参考《食品中总砷及无机砷的测定》（GB 5009.11—2014），得回归方程Y＝283.24X+36.966（r＝0.997 7）。

2.1.4 铅测定 采用火焰原子吸收法进行测定，具体参考《食品中铅的测定》（GB 5009.12—2017），得回归方程Y＝0.02X-0.001 7（r＝0.997 6）。

2.2 菌株分子鉴定 采用真菌通用引物对核糖体18 s 进行扩增，引物为3NDF，5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-′；V4R，5′-ACGGTATCTAGATCAGTCTTCG-3′。菌株DNA 的提取参考天根基因组DNA 提取试剂盒（货号DP302-02）说明书；PCR 扩增程序为预变性，94 ℃4 min；变性94 ℃30 s，退火53 ℃40 s；延伸，72 ℃1 min，35 个循环；后延伸，72 ℃7 min；4 ℃保存。PCR 酶为2×Pfu PCR MasterMix（货号KP201-02）。PCR 产物测序由云南涛擎生物科技有限公司完成。采用Mega 4 构建系统发育树。

2.3 数据处理 数据分析采用软件SPSS 21.0；当因子≥3，采用单因素方差分析中的Turkey HSD 检验进行差异显著性分析；当分析2 个因子差异时，采用独立样本T检验。采用软件Sigmaplot 11.0 进行作图。

3 结果与分析

3.1 三七根内生真菌重金属耐性菌株初筛分析 由图1 可知，内生真菌在相同浓度砷或铅胁迫下，其生物量（菌丝干重）差异较大。在400 mg/L As5+胁迫下，菌株Pn-6、Pn-7、Pn-11、Pn-17 和Pn-18 不能生长，而菌株Pn-12、Pn-13 和Pn-21 则生长较好，菌丝干重分别为0.25、0.24、0.24 g（见图1A）。在200 mg/L Pb2+胁迫下，菌株Pn-2、Pn-4、Pn-10、Pn-11 和Pn-17 不能生长；菌株Pn-13、Pn-25 和Pn-12 生物量相对较高，分别为0.27、0.21、0.20 g（见图1B）。综合As5+、Pb2+胁迫下内生真菌菌丝干重测定结果，选择菌株Pn-12 和Pn-13 进行下一步研究。

图1 不同重金属处理对三七根内生真菌菌株生长的影响

3.2 不同重金属浓度对耐性菌株生物量及重金属含有量积累的影响 由图2 可知，随着As5+或Pb2+处理浓度的升高，菌株Pn-12、Pn-13 生物量（菌丝干重）逐渐降低。截止As5+浓度达到800 mg/L，菌株Pn-12 菌丝干重与无重金属处理比较，无显著差异，但在1 600 mg/L·As5+处理下，Pn-12 菌丝干重下降明显，与前4 个处理浓度比较，差异显著。菌株Pn-13 菌丝干重则在800 mg/L 胁迫下下降明显，与前3 个处理浓度比较，差异显著，但与1 600 mg/LAs5+无显著差异。在不同Pb2+胁迫下，菌株Pn-12、Pn-13 菌丝干重变化规律同As5+胁迫下的变化规律基本一致，在0～400 mg/L范围内，菌株Pn-12 菌丝干重下降平缓，无显著差异，但与800 mg/L 比较，差异显著；而在0～200 mg/L范围内，菌株Pn-13 菌丝干重之间无差异显著，但与400、800 mg/L 胁迫下菌丝干重比较，呈显著差异。菌株Pn-12与Pn-13 菌丝干重在高浓度As5+（800、1 600 mg/L）和Pb2+（400 mg/L）胁迫下差异显著，表明菌株Pn-12 砷、铅耐性强于Pn-13。

图2 不同As5+、Pb2+处理浓度对菌丝干重的影响

由图3 可知，随着As5+、Pb2+浓度的增加，菌丝中的重金属含有量快速增加，且在0～800 mg/L Pb2+或400～1 600 mg/L As5+胁迫下，菌株Pn-12、Pn-13 菌丝重金属含有量在每两浓度之间差异显著。在200～1 600 mg/L As5+处理下，菌株Pn-12、Pn-13 菌丝重金属含有量分别从1.87、2.52 mg/kg 增至33.40、21.62 mg/kg，分别增加了17.86、8.58 倍。由此可知，菌株Pn-12 在砷积累能力方面强于Pn-13，且在1 600 mg/L 处理下呈显著差异。在100～800 mg/L Pb2+处理下，菌株Pn-12、Pn-13 菌丝重金属含有量分别从15.47、12.34 mg/kg 增至204.35、112.32 mg/kg，分别增加了13.21、9.10 倍，并看出菌株Pn-12 在Pb 积累能力方面同样优于Pn-13，且在4 个处理浓度下，均差异显著。总体来看，砷、铅在菌株Pn-12、Pn-13 菌丝中的积累状况呈现砷低铅高现象。

图3 不同As5+、Pb2+处理浓度对菌丝重金属积累的影响

3.3 重金属耐性菌株分类学地位鉴定 分别以菌株Pn-12、Pn-13 扩增序列进行BLAST 比对，收集一致性较高的其他物种序列构建NJ 系统发育树文本，并以鳗弧菌Vibrio anguillarum作为外群构建系统发育树。结果显示，菌株Pn-12与球孢枝孢霉Cladosporium sphaerospermum聚为一枝，同源性100%。菌株Pn-13 与支孢样支孢霉C.cladosporioid聚为一枝，同源性亦为100%，初步判定菌株Pn-12、Pn-13 分别为球孢枝孢霉C.sphaerospermum、支孢样支孢霉C.cladosporioid。见图4。

图4 基于核糖体18 s 氨基酸序列菌株Pn-12 和Pn-13系统进化树

4 讨论

目前对农业土壤重金属污染的治理多采用农艺措施，如减少含砷农药的使用、规范化种植、使用土壤改良剂、合理施肥等［14］，而利用绿色、高效、无污染的生物手段治理或缓解土壤重金属污染则是众多研究人员关注的焦点，尤其是利用与植物关系密切的内生菌［15］。诸多研究发现，AMF 与宿主植物的重金属耐性密切相关，在Cd、Pb 等重金属胁迫下，接种AMF 至酸浆果、茄子、扁豆根部，可明显提高宿主抗氧化能力、生物量和产量［16-18］。而DSE 在提高宿主植物重金属耐性方面同样发挥着重要作用，有研究发现，DSE 可通过将重金属（Cd）固定在菌丝或须根细胞内，从而提高玉米的重金属耐性，但DSE 提高宿主重金属耐性的调控机制仍不明确［19-21］。DSE 等根系优势的共生真菌可以通过分泌小分子有机酸等多种途径强化宿主植物的植物钝化效应，从而阻止植物重金属的吸收和积累［22］；也有部分研究表明，DSE 菌株可通过外排机制将重金属离子排出根系，从而提高宿主重金属耐性［23］。目前尚未见将DSE 应用于三七重金属污染治理的报道，本研究发现，分离自三七根部的DSE 菌株具有一定的重金属耐性，部分菌株（Pn-12、Pn-13）对As5+、Pb2+具有超高耐性，且重金属在菌丝中的积累存有一定的差异（砷低铅高），证明菌株Pn-12、Pn-13 对As5+、Pb2+的耐性机制不同，推测菌株Pn-12、Pn-13 主要通过金属离子外排机制来提高As 耐性，而通过金属离子菌丝积累机制（如将金属离子络合物储存在液泡中）增强Pb 耐性，但需进一步研究明确。待明确其作用机制后，则可将其制成接种菌剂，回接至三七须根部位，通过形成菌根体系，利用菌株外排或积累作用，从而减轻As、Pb 在三七根部的积累，进而保障三七的品质质量。本研究结果在解决三七及其他中药材种植过程中的重金属污染问题方面具有广阔的应用前景，同时也可为发展中药材生态种植业提供理论依据和数据支持。

5 结论

分离自三七根DSE 菌株Pn-12，Pn-13 具有较高的砷、铅耐性，且菌株Pn-12 砷、铅耐性强于Pn-13；但二者菌丝中砷、铅含有量差异较大，存在砷低铅高的现象，表明菌株Pn-12，Pn-13 对砷、铅的耐性机制存有一定的差异。初步鉴定菌株Pn-12、Pn-13 分别为球孢枝孢霉、支孢样支孢霉。