董瑞珍，陈 垣，2*，郭凤霞*，李 欠

（1.甘肃农业大学农学院，生命科学技术学院，甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室，甘肃省药用植物栽培育种工程研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃天士力中天药业有限责任公司，甘肃省特色药用植物资源保护与利用工程实验室，甘肃省特色药材规范化可追溯栽培工程技术研究中心，甘肃 定西 748100）

大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效。用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿；外治烧烫伤［1］。大黄属的不同种在我国分布地域性很强，药用大黄主要分布在四川、云南、贵州等一带高原山地地区；唐古特大黄主要分布在青藏高原一带高寒阴湿地区；掌叶大黄主要分布在甘肃省礼县一带山地林缘半阴湿地带。大黄野生资源已趋于濒危，药源主要为栽培品。甘肃省主要栽培唐古特大黄和掌叶大黄。甘南州一带主产唐古特大黄，礼县一带是掌叶大黄的主要道地产区，礼县大黄块形大，质地坚实，药理性能好，品质优良，有效成分含有量居中国掌叶大黄之首。

大黄是我国传统大宗中药材品种之一，具有重要的药用价值。中药质量评价是中药研究和应用领域的重点和难点［2］。目前，对大黄化学成分的研究主要集中在蒽酮衍生物类、蒽醌类、蒽酮类等。其中蒽醌类和蒽酮类是大黄的有效成分，是主要的蒽醌衍生物［3］。现代药理研究表明大黄中蒽醌类成分有抗菌［4-5］、抗病毒［6-10］、抗肿瘤［11-15］活性；蒽酮类成分具有泻下作用［16］；而儿茶素和没食子酸有止血作用［17］。但由于大黄存在品种来源不清、药源混乱、生长地域差异性大、采收时间不当和加工贮藏条件不同等因素，导致市售大多数大黄总蒽醌和游离蒽醌含有量达不到2015 年版《中国药典》要求，严重影响大黄生产成效。对道地产区栽培大黄制定统一的质量标准显得至关重要。指纹图谱技术是国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段之一［18］，能够反映出中药中所共有的、具有特异性的某类或数类成分［19］。刘欣等［20］建立了12 批大黄样品的HPLC 指纹图谱；杜清涛等［21］通过不同品种不同产地大黄UPLC 指纹图谱研究，发现3 个品种大黄对照药材区别特征明显；陈斌等［22］建立的不同产地掌叶大黄HPLC 指纹图谱共有模式作为大黄药材具有专属性的指纹图谱。本研究建立大黄HPLC 指纹图谱，并对结果进行聚类分析和主成分分析，以期为大黄质量监控提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；QE-200 高速粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；ME204/02型电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ2000VDE 型双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB 循环水式多用真空泵（郑州长城工贸有限公司）。

1.2 材料 没食子酸（批号110831-201605，纯度≥90.8%）、儿茶素（批号110877-201604，纯度≥99.2%）、番泻苷B（批号110825-201502，纯度≥98.0%）、番泻苷A（批号110824-201702，纯度≥98.0%）、大黄素甲醚（批号110758-201415，纯度≥99.1%）、大黄酸（批号110757-200206，纯度100%）、芦荟大黄素（批号110795-201308，纯度≥97.8%）、大黄酚（批号110796-201520，纯度≥99.2%）、大黄素（批号110756-201520，纯度≥98.7%）、土大黄苷（批号110794，纯度≥98.8%），均购自中国食品药品检定研究院。

13 批不同来源的大黄样品，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定其中12 批是掌叶大黄、1 批是唐古特大黄，见表1，均为2017 年采收的3 年生大黄，大黄在采挖后随即切除侧根，刮去外皮，切段或瓣，绳穿成串干燥或直接干燥和熏干。其中掌叶大黄陇南武都、宕昌和平凉华亭产区晒干，礼县主要是熏干；而甘南州唐古特大黄晒干。

表1 样品信息

2 方法

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～20% A；10～30 min，20%～35% A；30～40 min，35%～40%A；40～50 min，40%～48%A；50～70 min，48%～55% A；70～80 min，55%～60% A；80～95 min，60%～90% A；95～100 min，90%～10% A；100～110 min，10%A）；体积流量0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.2 供试品溶液制备 精密称定1.5 g 大黄样品粉末（过4 号筛），置具塞锥形瓶中，加10 mL 0.1% NaHCO3水溶液，称定质量，超声（30～40 ℃，700 W）处理20 min，再加入40 mL 甲醇，超声处理50 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量。经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称定适量没食子酸、儿茶素、番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，加甲醇分别制成质量浓度分别为0.158 2、0.104 7、0.302 8、0.215 1、0.104 1、0.104 0、0.126 3、0.113 9、0.047 4 mg/mL 的溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明该仪器精密性良好。

2.4.2 稳定性试验 精密称定S2 号大黄药材粉末（过4号筛）1.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12、24、32、48 h 进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取S2 号大黄药材粉末（过4号筛）6 份，每份1.5 g，，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

3 结果

3.1 指纹图谱建立 取上述13 批大黄药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录大黄样品在110 min 内的色谱图。用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）对其进行处理，共标定15个共有特征峰，作为判别大黄的群体特征峰［23］，见图1。通过对比掌叶大黄药材指纹图谱、唐古特大黄药材指纹图谱，见图2，发现唐古特大黄色谱峰在19～70 min 内整体色谱峰高且多于掌叶大黄，（峰11～15）5 种蒽醌成分含有量唐古特大黄较为均衡，而掌叶大黄5 种蒽醌成分含有量差异较大。在与相同条件下生成的对照品色谱图比对之后。确定1 号峰为没食子酸、2 号峰为儿茶素、7 号峰为番泻苷B、9 号峰为番泻苷A、11～15 号峰依次为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。

图1 13 批样品HPLC 指纹图谱

3.2 相似度分析 将13 批样品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）进行分析处理，采用中位数法，以S1 号样品色谱图为参照图谱，随后进行多点校正和Mark 峰自动匹配，生成大黄药材对照图谱见图3。与对照图谱进行相似度评价，结果见表2。发现13 批样品的相似度差异较大，其中12 批掌叶大黄图谱相似度在0.598～0.987 之间，而唐古特大黄相似度为0.390。表明不同产地和不同品种大黄的出峰时间差异比较明显。

图2 各成分HPLC 色谱图

图3 大黄药材对照图谱

表2 13 批样品相似度

3.3 聚类分析 运用SPSS 20.0 分析软件对13 批样品HPLC 指纹谱图的15 个共有特征峰峰面积原始数据标准化处理后，以平方Euclidean 距离为度量标准，组间联接的聚类方法进行系统聚类分析，结果见图4。可以看出，13 批样品可分为6 类，其中甘南州卓尼县扎古录镇（唐古特大黄）为第1 类；陇南市武都区池坝乡、礼县草坪乡、礼县白河镇为第2 类；宕昌县狮子乡为第3 类；礼县沙金乡为第4 类；宕昌县哈达铺为第5 类；平凉市华亭县马峡镇、陇南市宕昌县南阳镇、礼县铨水乡、礼县桥头镇、礼县洮坪乡、宕昌县竹院乡为第6 类。

图4 13 批样品聚类分析树状图

3.4 主成分分析 利用SPSS 20.0 软件中的因子分析对13批样品的15 个共有特征峰峰面积数据进行标准化处理，计算相关系数矩阵、主成分特征值和方差贡献率。主成分特征值和方差贡献率是选择主成分的依据，载荷矩阵反映了各变量对主成分的重要程度［24］。由相关系数矩阵可以看出多数变量间存在相关关系，见表3，因此有必要进行因子分析。经因子分析所得的前5 个主成分特征值＞1，累计方差贡献率为89.473%，它代表了13 批样品图谱中15 种成分的绝大多数信息，具有很好的代表性，可用于大黄药材的质量评价。结合主成分特征值和方差贡献率、初始因子载荷矩阵、主成分三维图，见表4～5、图5。可知，第1 主成分的特征值为5.142，方差贡献率为38.240%，载荷较高的峰有峰3～6、8，表明这5 个峰主要反映第1 主成分的信息；第2 主成分的特征值为3.319，方差贡献率为22.125%，主要反映峰10、13～14 的信息；第3 主成分的特征值为2.294，方差贡献率为15.293%，主要反映峰9、11 的信息；第4 主成分的特征值为1.639，方差贡献率为10.929%，主要反映峰2、15 的信息；第5 主成分的特征值为1.027，方差贡献率为6.846%，主要反映峰12 的信息。

表3 相关系数矩阵

表4 主成分初始特征值和贡献率

表5 初始因子载荷矩阵矩阵

图5 主成分三维折线图

3.5 样品含有量测定 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测定结果见表6。结果显示，9 种成分总量S1、S2、S10、S11、S12 较好，S3、S5、S7 较差；游离蒽醌S2、S10、S12 较好，S3、S5、S7也较差；而没食子酸、儿茶素、番泻苷B 和番泻苷A 总量S1、S4、S5、S10 较好，S3、S7、S11、S12 较差。

4 讨论

4.1 条件优化 研究表明大黄中成分在波长280 nm 下指纹图谱峰容量较多，色谱信息丰富，基线平稳；不同的提取方式对色谱峰的容量及峰面积影响不大，故以超声为样品处理方式［25-26］。本研究通过对同一样品在相同色谱条件下比较254、260、280 nm 波长下的色谱图，结果显示280 nm较254、260 nm 下色谱峰数量多，峰面积大而且分离度好，因此选择280 nm。最终确定 “2.1”项下色谱条件。

4.2 质量评价 HPLC 图谱能够反映样品的整体性和特征性，是一种有效控制中药成分复杂多样质量不一的方法。龚小红等［27］通过对不同产地大黄13 种成分量进行主成分比较研究发现，27 批样品大黄的量存在较大的差异。王宁芳［28］对青海不同产区大黄的HPLC 指纹图谱的对比研究发现青海不同采集地唐古特大黄和掌叶大黄的平均相似度都在0.90 以上。本研究中13 批样品的相似度有较大差异性，只有6 批相似度在0.90 以上，表明不同大黄品种间自然形成的本质差异无法避免，但是药材产地、海拔、采挖时间及干燥方法等客观因素也可能导致大黄药材之间存在较大差异。主成分分析、聚类分析表明大黄药材的质量与生长环境、产地加工方法有一定的相关性，但又没有绝对的相关性。因此，建立全面系统的、可操作的大黄质量标准显得尤其重要。

4.3 结果分析 谭鹏等［29］研究结果表明唐古特大黄和掌叶大黄之间存在一定的质量差异，主要为结合型蒽醌糖苷类的含有量差异，这也表明了定量测定大黄中的结合型蒽醌糖苷类成分对于评价不同来源的大黄药材质量差异具有重要意义。本研究结果表明9 种成分总含量产地为陇南市武都区池坝乡、礼县草坪乡、礼县沙金乡、礼县洮坪乡、宕昌县竹院乡时较高，而产地为宕昌县狮子乡、哈达铺乡、南阳镇时较少；游离蒽醌含有量礼县草坪乡、礼县沙金乡、宕昌县竹院乡较高，宕昌县狮子乡、哈达铺乡、南阳镇较少；而没食子酸、儿茶素、番泻苷B 和番泻苷A 总含量武都区池坝乡、礼县白河镇和沙金乡、宕昌县哈达铺乡较高，宕昌县狮子乡、南阳镇、竹院乡、礼县洮坪乡较少。这进一步表明产地和加工方法不能作为大黄质量评价的唯一依据，应综合考虑产地、加工方法、土壤、海拔、气候的影响。

表6 各成分含有量测定结果（%）

5 结论

大黄化学成分复杂多样，单单凭借一种或几种化学成分不足以表明大黄整体的质量，而本研究所建立的方法，简便、快捷，稳定性、重现性良好，并通过含有量进行定量分析，以期为大黄药材质量控制和品质评价提供参考。