俞杞泉，张惠勇，杨 扬，寿伟臻，张 琨，李 阳

（1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；2.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203）

肺癌是目前世界上最常见恶性肿瘤，严重危害人类的健康。肺癌患者存在不同程度的免疫抑制情况［1-2］，人体免疫应答与肿瘤的发生发展及治疗存在着息息相关的联系［3］。手术联合放化疗是目前治疗肺癌的主要方式，环磷酰胺等临床常用的化疗药物对机体免疫功能的抑制已得到明确证实［4］。

据文献报道，中药及其复方抗肺癌的机理与改善肺癌患者机体免疫功能有密切关系［5］。本课题组前期研究发现，采用中药金宁方灌胃后提取的小鼠血清有明显的抑瘤作用［6］。为了进一步观察金宁方在免疫系统中的调控效应，本研究重点观察了金宁方对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的影响，初步探讨了该复方改善肺癌免疫功能低下状态并达到抗癌作用的可能机制。

1 材料

1.1 试剂 环磷酰胺（安道生，批号8D229 A，规格0.2 g/瓶）购自龙华医院西药房；RPMI-1640 培养液购买自美国ThermoFisher 公司；红细胞裂解液（Cat349202）购自美国BD 公司；刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA，CatC5275）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，Cat.L2630）均购自美国Sigma 公司；CCK-8 检测试剂（CK04）购自日本同仁化学科技有限公司。

1.2 动物 Balb/c 小鼠35 只，雌性，体质量18～20 g（6 周龄），SPF 级，购自西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号SCXK（沪）2013-0016）。饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF 屏障环境中，正常供食供水。所有实验操作均符合实验动物福利相关规定。

1.3 药物 金宁方（石上柏30 g、石见穿30 g、干蟾皮15 g、僵蚕15 g、生牡蛎30 g）购自江苏江阴天江药业有限公司，制成颗粒剂（批号1907344）。

1.4 仪器 血细胞分析仪（迈瑞医疗国际股份有限公司，BC-2800 Vet）；全波长酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司，Gemini XPS］。

2 方法

2.1 环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型 将小鼠按随机分为正常组、模型组、金宁方组，每组10 只。于实验第1、4、7 天给予环磷酰胺（75 mg/kg）腹腔注射诱导小鼠免疫抑制，在第10 天对各组小鼠进行安乐死处理，检测相关指标。在实验全程中监测小鼠体质量并观察实验动物整体状况。

2.2 给药 金宁方为中药配方颗粒，按金宁方复方比例混合后用纯水溶解。按小鼠/人代谢比推算小鼠每日给药剂量为20 g/kg，灌胃给药容量为0.1 mL/10 g。从第1 次环磷酰胺注射开始给药。正常组与模型组给予相同方式的等容量对照溶剂，连续干预10 d。

2.3 外周血细胞检测 在实验终点，取各组小鼠全血，并用枸橼酸钠进行抗凝处理。通过血细胞分析仪检测外周血中各血细胞比例，主要关注淋巴细胞数量和血红蛋白含量。

2.4 脾指数及脾淋巴细胞总数计数 在处死小鼠后，无菌取其脾脏，并对脾脏进行称重。根据实验终点小鼠体质量，计算每只实验动物的脾指数，脾指数＝脾脏质量（mg）/体质量（g）。将脾脏磨碎，过膜，1 200 r/min 离心5 min。弃去上清。沉淀加入红细胞裂解液每个脾脏约1 mL，混匀，静置1 min，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1～2 次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬起，对每份细胞样品进行活细胞计数，计算每只小鼠的脾脏中免疫相关细胞总数。

2.5 淋巴细胞增殖检测 将每份细胞样品的细胞浓度调至4×106/mL。于96 孔板中每孔加入相应体积的各组细胞样品悬液和有丝分裂原（终浓度为1 μg/mLConA 或2 μg/mL LPS），总体积200 μL。在对金宁方体外效应的评价中，则再加入终浓度为0.32、1.6、8 μg/mL 药物样品，并用无药物干预的丝裂原诱导细胞作为对照组，以细胞培养液（无细胞）为空白组。细胞于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养48 h，培养结束前6 h 每孔加入10 μL CCK8 反应试剂。用全波长酶标仪检测450 nm 处吸光度值（OD），对照组细胞的增殖率为100%，以空白组阴性对照孔的OD作为未增殖本底扣除，归一化计算并评价金宁方对于淋巴细胞增殖比率的影响。

3 结果

3.1 金宁方能改善免疫抑制小鼠的整体状况 经环磷酰胺诱导的小鼠表现出活动度下降、体质量减轻、排泄物不成形，甚至体温下降等整体毒副作用，而经金宁方干预小鼠则在整体水平上均有所改善。通过每日体质量监测发现金宁方能够明显缓解环磷酰胺诱导的小鼠体质量减轻，特别在环磷酰胺注射后的缓解期作用明显，与模型组比较，金宁方组小鼠体质量增加（P＜0.05，P＜0.01）。在实验终点对血红蛋白的监测中也能观察的金宁方恢复血红蛋白水平的趋势，但由于个体差异明显，差异无统计学意义。见图1～2。

图1 金宁方对免疫抑制小鼠体质量的影响（n=10）

图2 金宁方对免疫抑制小鼠血红蛋白的影响（n=10）

3.2 金宁方明显缓解免疫抑制小鼠的淋巴细胞数量减少 在针对免疫系统的大体评价中发现，金宁方能够明显缓解环磷酰胺引起的脾脏减小，金宁方组脾指数较模型组增加（P＜0.01）。而对脾脏中淋巴细胞总数和外周血淋巴细胞数量的计数中也反应出金宁方对于免疫系统的整体保护作用。见图3～5。

图3 金宁方对免疫抑制小鼠脾指数的影响（n=10）

图4 金宁方对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞总数的影响（n=10）

图5 金宁方对免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞的影响（n=10）

3.3 金宁方对于免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖反应的促进作用 而各组脾脏淋巴细胞在体外丝裂原诱导条件下，金宁方组与模型组比较也表现出更高的淋巴细胞增殖水平，提示复方对于免疫潜在活性的保护作用，其作用可能与记忆淋巴细胞相关。与体外药效评价实验结果一致，金宁方组较ConA 诱导的模型组淋巴细胞增殖率增加（P＜0.05），这可能与金宁方保护细胞免疫效应相联系。现代研究已证实，细胞免疫（特别是细胞毒性T 细胞）介导的抗肿瘤作用在癌症防治中发挥着核心的作用，而金宁方对于肺癌的治疗作用中对于免疫保护效应可能与促进了细胞免疫有关。见表1。

表1 不同诱导条件下金宁方对淋巴细胞的影响（，n=7）

表1 不同诱导条件下金宁方对淋巴细胞的影响（，n=7）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05。

3.4 金宁方具有促进体外淋巴细胞增殖水平效应 金宁方具有促进淋巴细胞增殖效应，且在不同诱导条件下均表现出量效关系，其中无丝裂原条件下促进比例明显，而在丝裂原诱导条件下作用较缓和，ConA 诱导较LPS 诱导作用更为明显，提示金宁方可直接活化淋巴细胞，并具有促进淋巴细胞增殖的活性，且对于细胞免疫可能发挥更明显的作用。见表2。

表2 不同诱导条件下不同浓度金宁方组的淋巴细胞水平（%，，n=3）

表2 不同诱导条件下不同浓度金宁方组的淋巴细胞水平（%，，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

免疫是机体抑制肿瘤发生、生长和转移的主动调控机制［7］，目前肿瘤的免疫治疗日益成为新兴的抗癌治疗手段，如基于促进细胞毒性T 细胞（CTL）和抑制免疫抑制性膜分子功能的相关药物正在FDA 开展临床研究。程小珍等［8］发现晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg 的比例显著高于健康体检者，表明肿瘤患者CD4+CD25+调节性T 细胞是晚期肺癌患者免疫抑制及肿瘤进展的原因之一。中医药在长期的历史传承中已被证明其安全性和临床有效性，特别对于免疫系统的调控作用也不断被证实具有其相关的药理作用［9-10］。现代中药注射液扶助正气、培植本元的药理作用证实调节免疫功能是其抗肺癌的重要作用途径之一［11］。

中医认为正气维系人体正常生命活动，是抗御外邪及防治疾病的基本物质。它的强盛衰败关系着人体的生命活动及疾病的转归。从这个意义上讲，中医学正气体现了现代医学的人体免疫功能［12］。人体正气虚弱导致邪气乘虚而入，肺失宣肃而致气血津液输布不利，体内湿饮凝聚成痰，痰湿与血瘀互结，凝为积聚。与此同时，积聚又加剧了体内气血津液运行不畅，脏腑失养而致机能不调、免疫低下。

金宁方主要由石上柏、石见穿、干蟾皮、僵蚕、生牡蛎等药物组成，具有清热解毒、化痰软坚之功，被长期用于临床肺癌病人的治疗，并在III 期肺癌术后抗复发转移中被证明具有积极的作用，能明显改善中医临床症状，提高生存质量［13］。据文献报道，以石上柏组方的加味百合固金汤及金复康口服液均有扶正祛邪、提高免疫功能的作用［14］。现代药理学研究证明，干蟾皮提取物华蟾素及牡蛎提取物牡蛎多糖均具有免疫增强作用［15-16］。

本研究基于免疫抑制小鼠模型，初步探讨了金宁方对于免疫功能的保护和增强作用的可能机制。在体外研究中，发现金宁方能够在较低药物浓度范围内对淋巴细胞的增殖反应发挥浓度依赖的促进效应。由于复方的体内吸收代谢过程复杂，因此又通过小鼠体内研究同样证实了金宁方对维持机体整体平衡及淋巴细胞整体水平均具有积极的治疗作用。体内外研究同时也显示金宁方对于免疫系统的保护作用可能更倾向于对T 淋巴细胞反应的保护，这可能提示与药物的抗肿瘤效应密切相关，达到祛邪与扶正的统一。本次研究主要基于体内免疫抑制的微环境探讨金宁方的免疫保护作用，在后期研究中则需通过荷瘤小鼠模型，如原位肺癌模型进一步明确药物的抗肿瘤效应和药理作用，特别是对于免疫的调控机制。而复方成分复杂，则需在严格药物质量控制的前提下，通过运用现代高通量研究手段，并结合生物信息分析方法开展复方的综合药理研究。在后续研究中，希望通过对金宁方的具体药物机制阐述为临床治疗提供更明确的科学依据，也为中医复方研究提供可参考的现代研究模式。