张二飞，殷 紫，杨礼白

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2.江苏护理职业学院，江苏 淮安 223005；3.淮安市中医院，江苏 淮安 223001）

随着经济社会的发展，人们的饮食习惯和结构随之改变，痛风性肾病患病率正在逐年增长。痛风性肾病，又称尿酸性肾病（uric acid nephropathy，UAN），病因是患者体内嘌呤代谢紊乱，血液中的尿酸排泄减少或者生成过多，在肾间质的髓质、远端集合管易形成高尿酸盐的晶体沉积，进而导致的肾损伤的一类疾病［1-3］，其临床表现主要为腰部酸痛、尿量增加、夜尿增加、轻度尿蛋白、尿血、肾功能不全、高血压、水肿等，少数可表现为急性肾衰竭。目前，西医治疗本病主要通过降低血尿酸水平，抑制尿酸生成或增加尿酸排泄为主，如非布司他、别嘌醇、苯溴马隆等，但毒副作用较大，无法改善病理改变，长期服用会导致肝肾功能损害且易复发［4］。研究表明，传统的中医药治疗痛风性肾病毒副作用较小疗效显著［5-8］。健脾清热利浊汤为江苏省淮安市中医院的临床经验方，主要由茯苓、薏苡仁、萆薢、虎杖、六月雪等多味中药组成，具有利水渗湿，清热解毒，活血散瘀等功效，临床治疗痛风性肾病疗效较好，但具体作用机制尚不明确。因此，本研究应用乙胺丁醇联合腺嘌呤建立UAN 大鼠模型，考察健脾清热利浊汤对其肾脏保护作用及其相关机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SPF 级SD 大鼠共100 只，体质量（200±20）g，购于南京青龙山动物繁殖厂（生产许可证号SCXK（苏）：2017-0001），动物自由进食及饮水。

1.2 药物 健脾清热利浊汤由萆薢、茯苓、薏苡仁、泽泻、虎杖、六月雪、苍术、黄柏、秦艽、地鳖虫等组成，健脾清热利浊汤加8 倍量水浸泡1 h，加热沸腾后再回流1 h，滤过备用，剩余药材再次加6 倍量水，再次加热回流提取1 h，合并2 次滤液，滤过浓缩成浸膏（生药量5 g 生药/mL）；盐酸乙胺丁醇片（成都锦华药业有限公司，国药准字 H51020917）；腺嘌呤（美国Sigma 公司，批号102076748）；苯溴马隆片（德国赫曼大药厂，批号H20171301）。

1.3 试剂 大鼠尿蛋白定量试剂盒（上海盈公酶联生物有限公司，批号YG-E-5096）；大鼠尿素氮（BUN）（ELISA）试剂盒（北京绿源伯德生物科技有限公司，批号DG21036D-48）；IgG（HRP）（英国Abcam 公司，货号ab6734）；尿酸检测试剂盒（莱尔生物有限公司，批号LE-06203）；大鼠肌酐（SCr）试剂盒（北京绿源伯德生物科技有限公司，批号DG94526Q-48）；GLUT9（英国Abcam公司，货号ab223470）；ABCG2（英国Abcam 公司，货号ab207732）；免疫组化通用型试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号13J31H10J1022）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号YA11098000AL）；免疫组化DAB 试剂（武汉博士德生物工程有限公司，批号13I04A22）。

1.4 仪器 台秤（上海月梓电子科技有限公司，型号MH5MB）；电热培养恒温箱（上海善志有限公司，型号DHP-9052）；石蜡切片机（德国莱卡公司，型号CUT4062）；显微镜（日本奥林巴斯株式会社，型号BX-53）；烤片机（德国莱卡公司）；包埋机（德国莱卡公司，型号EG1160）；生物组织脱水机（孝感奥华医疗科技有限公司）；防脱载玻片（杭州晓柚科技有限公司）；酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号AMR-100）；高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号TGL-20M）。

2 方法

2.1 造模与给药 选取60 只大鼠喂养1 周后分组，分为正常组、苯溴马隆片组、模型组及健脾清热利浊汤低、中、高剂量组，每组10 只。正常组蒸馏水灌胃；其他组每天灌胃乙胺丁醇（250 mg/kg）和腺嘌呤（200 mg/kg）进行造模15 d。第8 天开始给予苯溴马隆10 mg/kg、健脾清热利浊汤3 g 生药/kg、6 g 生药/kg、12 g 生药/kg，给药容量为20 mL/kg，给药1 次/d，治疗周期为28 d；模型组在第8天后等容量蒸馏水灌胃。

2.2 样本留取和指标观察

2.2.1 尿量与尿蛋白 各组在给药的第28 天，测定24 h尿量，同时进行24 h 尿蛋白水平检测。

2.2.2 血液 28 d 后，腹腔注射10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉，腹主动脉采血，离心（3 000 r/min）10 min，取上清液，ELISA 测血清尿酸、肌酐、尿素氮。

2.3 肾组织形态学观察 大鼠腹主动脉取血后立刻解剖摘取右侧肾组织，剥离肾外膜，将肾脏称重。肾脏置于4%的多聚甲醛中固定，用于HE 染色及免疫组织化学检测。

2.3.1 HE 染色 按照常规HE 染色方法进行。

2.3.2 免疫组化染色 将肾脏切片置于烘箱内60 ℃，脱蜡，至水；PBS 洗涤2 次，10 min/次，3% H2O2室温放置10 min，灭活内原性酶，0.01 mol/L 枸橼酸盐溶液，加热至沸腾后，室温放凉，PBS 洗涤2 次，10 min/次，5% BSA封闭液，室温20 min，滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜。PBS 洗涤3 次，10 min/次，滴加生物素化兔抗大鼠IgG，37 ℃孵育20 min，PBS 洗涤3 次，10 min/次，DAB 显色，苏木素复染，脱水、透明、树脂胶封片，显微镜下观察，拍照采集信息，并用Image J 软件进行数据分析。

2.4 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行统计学处理，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般观察 与正常组相比，模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿，体质量增加缓慢等症状，造模过程中，有1 只大鼠死亡，实验结束后，每组大鼠分别为正常组10 只，模型组9 只，健脾清热利浊汤高剂量组10 只，中剂量组10只，低剂量组10 只，苯溴马隆组10 只。

3.2 健脾清热利浊汤对痛风性肾病大鼠24 h 尿量及尿蛋白影响 与正常组比较，模型组大鼠24 h 尿量升高（P＜0.01）；尿蛋白量升高（P＜0.05）。与模型组相比，健脾清热利浊汤12 g/kg 剂量组，24 h 尿量降低（P＜0.01）；尿蛋白量降低（P＜0.05）。苯溴马隆片组24 h 尿量及尿蛋白含量降低（P＜0.01）；健脾清热利浊汤6 g/kg 剂量组尿量降低（P＜0.05）。见表1。

表1 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠24 h 尿量及尿蛋白定量的影响（）

表1 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠24 h 尿量及尿蛋白定量的影响（）

注：与正常组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与模型组相比，*P ＜0.05，**P＜0.01。

3.3 健脾清热利浊汤对痛风性肾病大鼠模型肾系数的影响 与正常组相比，模型组大鼠肾系数（大鼠双侧肾脏的质量与体质量的比值）升高（P＜0.01）。健脾清热利浊汤6 g/kg 剂量组、12 g/kg 剂量组及苯溴马隆片10 mg/kg 组肾系数降低（P＜0.01）。见表2。

表2 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾系数的影响（）

表2 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾系数的影响（）

注：与正常组相比，## P ＜0.01；与模型组相比，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.4 健脾清热利浊汤对痛风性肾病大鼠模型尿酸、肌酐及尿素氮的影响 模型组与正常组比较，尿素氮、尿酸及肌酐升高（P＜0.01）。健脾清热利浊汤12 g/kg 剂量组与模型组相比尿素氮、尿酸及肌酐降低（P＜0.01）；健脾清热利浊汤6 g/kg 剂量组与模型组相比尿素氮、肌酐及尿酸降低（P＜0.05）；苯溴马隆片10 mg/kg 组与模型组相比尿素氮、肌酐降低（P＜0.01），尿酸降低（P＜0.05）。见表3。

3.5 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾组织形态学影响 模型组大鼠的肾组织的HE 染色显示肾小球部分萎缩（箭头表示），肾小管细胞在不同程度上弥漫性肿胀（圆圈表示），尿酸钠晶体沉积在小管和间质中并且纤维组织（正方形表示），但健脾清热利浊汤组及苯溴马隆组可以不同程度减轻肾损伤。见图1、表4。

表3 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影响（）

表3 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影响（）

注：与正常组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图1 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾脏形态学的影响（HE，×40）

表4 健脾清热利浊汤对肾脏病理切片肾小管个数和病变面积（）

表4 健脾清热利浊汤对肾脏病理切片肾小管个数和病变面积（）

注：与正常组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表达的影响 与正常组相比，模型组ABCG2 阳性细胞表达降低，GLUT9 阳性细胞表达增加（P＜0.01）；与模型组相比，健脾清热利浊汤高剂量组12 g/kg、苯溴马隆片组增加ABCG2 表达增加（P＜0.05）；GLUT9 表达降低（P＜0.01）；见图2～3、表5。

图2 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾脏ABCG2 的影响（×40）

图3 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠肾脏GLUT9 的影响（×40）

表5 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表达的影响（）

表5 健脾清热利浊汤对痛风性肾病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表达的影响（）

注：与正常组比较，## P ＜0.01，与模型组比较，* P ＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

中医认为痛风性肾病患者的病机多为湿、热、瘀，表现为湿热内蕴，脉络瘀阻。故治疗原则应为清热、祛湿、活血、通络［9-10］。健脾清热利浊汤由萆薢、茯苓、薏苡仁、六月雪、虎杖、泽泻、苍术、黄柏、秦艽、地鳖虫等组成，具有利水渗湿，清热解毒，活血散瘀的功效。

尿蛋白是反映肾功能是否正常的重要指标。肾指数、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）是检测肾功能的主要指标之一，这些指标反映了肾小球的滤过、肾小管重吸收等功能。当肾发生实质损害时，降低肾小球的滤过率，导致血清Scr、BUN 浓度升高。

多种尿酸盐转运蛋白参与人近曲肾小管对尿酸盐的转运［10］，如ATP 结合转运蛋白G2（ABCG2）及葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）［11-12］。GLUT9 可将尿酸重吸收至上皮细胞内，再将尿酸转运到血液中。ABCG2，是一种高效的尿酸转运蛋白，可将尿酸转运至肾小管管腔，经尿液排出体外，可见GLUT9 与ABCG2 尿酸盐转运体良性调控可有效促进肾脏尿酸排泄，降低血尿酸［13-14］。

在本研究中，健脾清热利浊汤显著降低了24 h-蛋白尿、肾系数、尿酸、Scr、BUN 的水平。此外，肾组织学显示，健脾清热利浊汤可明显抑制GLUT9 蛋白表达，促进ABCG2 蛋白表达，表明健脾清热利浊汤可通过上调肾小管上皮细胞中的ABCG2 来促进肾脏对尿酸的排泄；同时下调GLUT9 来抑制肾脏对尿酸的重吸收，最终达到降低血尿酸水平的作用，说明健脾清热利浊汤具有改善肾功能的作用。

研究表明健脾清热利浊汤可通过抑制患者肾脏中GLUT9 和提高ABCG2 尿酸盐转运体的蛋白表达水平，降低肾小管对尿酸的重吸收，促进尿酸排泄，实现减少尿酸、BUN 和Scr 的水平，从而达到保护肾脏的作用。