阚玉璇 ，曾梦楠，张贝贝，李本科，刘 莉，冯卫生，郑晓珂*

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046；3.贵州汉方药业有限公司，贵州 贵阳 550014）

近年来，男性生殖障碍疾病的发病率逐渐上升，单纯的遗传缺陷已经无法解释其高发病率现象，越来越多的证据表明环境或生活方式的因素才是导致发病率上升迅速的重要原因［1］。环境雌激素是环境中一类具有雌激素活性的内分泌干扰素，能够导致雄性生殖能力降低、生精功能受损等多种生殖障碍［2］。而环境雌激素广泛存在于人类和动物排泄物、植物性化合物以及塑料制品和残留农药中，其中人类和各种大型家畜排泄物中类固醇雌激素是城镇和农村地表水的重要污染源。己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）则是一种常见的环境雌激素，是人工合成的非甾体雌激素物质，研究表明，DES 能够导致睾丸癌、尿道下裂、精子数量下降、受精能力降低等病症［3-4］。DES 对雄性生殖系统不良影响的报道已有不少，其也是制备生精障碍常用造模药。杜仲补天素胶囊由二十余味中药组成，气微，味酸、微甘，具有温肾养心、壮腰安神的功效，其中杜仲、菟丝子、肉苁蓉等均有补肾益精的功效，临床上多用于腰脊酸软、神疲乏力等症状。中医学认为肾为脏腑之本，十二经之根，先天之本在于肾［5］。《素问·上古天真论》曰：“肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”［6-7］，生殖之精藏于肾，精的产生、成熟与肾息息相关。中医认为“肾主生殖”，若肾精衰少、肾气不足则无子。在传统的中医药临床应用及实验均已证实：通过补肾治疗后，生殖功能的确有所改善［8-9］。而具有补肾功能的杜仲补天素胶囊是否对小鼠生精障碍有改善作用未见报道，故本实验的目的在于探究杜仲补天素胶囊对己烯雌酚诱导的雄性小鼠生精障碍的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级BALB/c 小鼠60 只，雄性，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。

1.2 药物与试剂 杜仲补天素胶囊、生精胶囊，均购自贵州汉方药业有限公司（批号2558002、20180701）；己烯雌酚（批号OB913-1 g）购自九鼎化学科技有限公司；橄榄油（批号R002010-500 mL）购自上海百舜生物科技有限公司；雌二醇（E2）、睾酮（T）、促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成素（LH）试剂盒购自美国R＆D 公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）购自南京建成生物技术研究所；一抗TLR4、一抗MYD88 购自英国Abcam 公司；羊抗兔二抗（批号925-68071）购自美国LI-COR 公司。

1.3 仪器 BD FACS Aria III 流式细胞仪（美国BD 公司）；JFX-B 精子质量分析仪（石家庄华众医疗用品有限公司）；Odessey 双色红外激光成像系统（美国LI-COR 公司）；TMC 恒温孵育器（合肥艾本森科学仪器有限公司）；Centrifuge-5804R 小型高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；半干转膜仪（美国BIO-RAD 公司）；微量加样器（德国Eppendorf 公司）；WD-9405B 型水平摇床（北京市六一仪器厂）；DYY-24DN 电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 分组与给药 60 只雄性BALB/c 小鼠正常喂养7 d后，随机分为6 组，正常组、溶剂对照组、DES 模型组、阳性药生精胶囊组、杜仲补天素胶囊低剂量和高剂量组。生精胶囊和杜仲补天素胶囊均以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂，生精胶囊组每只按照0.8 g/kg 灌胃给药，杜仲补天素胶囊低剂量组和高剂量组分别按照0.347、1.388 g/kg 灌胃给药，正常组灌胃等剂量的水、溶剂对照组和DES 模型组灌胃等剂量0.5%羧甲基纤维素钠溶液。4 h 后，DES 模型组、阳性药组和杜仲补天素组腹腔注射40 mg/kg 以橄榄油为溶剂的DES，溶剂对照组分别腹腔注射等剂量橄榄油。连续7 d，末次注射后禁食24 h，取材。

1.4.2 脏器指数 小鼠眼球取血处死后，取心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾称重，计算各脏器系数。计算公式：脏器系数＝（各脏器质量/小鼠体质量）×100%。

1.4.3 睾丸、附睾组织切片观察 取左侧睾丸及附睾，浸于3.7%甲醛溶液固定，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片厚5 mm，用苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察肾组织形态变化。

1.4.4 精子数量及活力检测 取右侧附睾于1.5 mL 离心管，加入500 μLPBS，剪碎，放置恒温孵育器孵育10 min，使精子充分游离，再加入PBS 500 μL，用40 μm 滤膜过滤，取20 μL 精子悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于精子质量分析仪检测细胞活力。另取500 μL 精子悬液于离心管中，加入500 μL 5%的碳酸氢钠溶液，摇匀，于计数板上计数。

1.4.5 性激素水平的检测 取各组小鼠血液4 ℃离心，3 000 r/min，10 min；取上清于-80 ℃保存，备用。采用酶联免疫法检测血清中雌二醇（E2）、睾酮（T）、促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4.6 氧化应激指标的检测 取右侧肾组织，制成10%匀浆，采用硫代巴比妥酸法（TBA 法）检测组中MDA 水平、羟胺法检测SOD 水平、比色法检测GSH-Px 水平，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.7 原代肾细胞凋亡检测 取新鲜左侧肾组织，快速去除肾包膜剪碎，加入PBS 清洗，离心弃上清，重复清洗两次。然后加入1 mL 胰酶消化，3 min 后立即加入胎牛血清终止消化，用70 μm 滤网过滤，收集滤液，1 500 r/min 离心5 min，弃上清得原代细胞，各加入100 μL 1x Binding Buffer，转移至流式管。通过AnnexinV-PE/7-AAD 方法检测并分析细胞凋亡情况。

1.4.8 原代肾细胞ROS 检测 原代肾细胞提取同“1.4.7”项。按照ROS 检测试剂盒说明书配制样本，流式细胞仪检测并分析细胞ROS 水平变化

1.4.9 蛋白印迹法检测肾脏中TLR4、MyD88 蛋白的表达 取肾脏组织，按照总蛋白提取试剂盒操作，提取各组小鼠肾脏总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白按照相对分子质量的大小分离成不同的条带，将内参蛋白和目的蛋白转移到PVDF 膜上，用5% 的脱脂奶粉于摇床封闭1 h，加入一抗TLR4（1∶500）、MyD88（1∶200）和兔源内参蛋白β-actin（1∶1 000），室温孵育0.5 h 后，4 ℃冰箱孵育过夜，用PBST 洗涤5 次，每次5 min，加入二抗（1∶20000），室温避光孵育1 h，再次用PBST 洗涤，用Odyssey 双色红外激光成像系统进行扫描分析。

2 结果

2.1 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠睾丸病理形态的影响 正常生理状况下，小鼠曲细精管排列紧凑，形态清晰，各级生精细胞层次分明，管腔内充满大量发育成熟的精子（图1 A）；己烯雌酚则可以使小鼠的曲细精管间隙增大，细胞排列疏松，生精细胞层次不明且数量减少（图1C）。生精胶囊组（图1D）小鼠曲细精管结构与正常组接近，各级生精细胞排列有序且数量增多。给药杜仲补天素胶囊之后，小鼠曲细精管间隙减小，细胞排列稍紧密，高剂量尤为突出（图1E～F）。

2.2 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠睾丸、附睾系数和精子的影响 精子数量与精子活力最能体现生殖功能，而睾丸及附睾则是精子主要产生和运输的器官。如表1 所示，与正常组相比，己烯雌酚可以使小鼠睾丸系数降低（P＜0.05），精子数量和精子活力降低（P＜0.01），给药后，与模型组相比，杜仲补天素低剂量组睾丸系数升高（P＜0.05），高剂量组和生精胶囊组升高（P＜0.01）；生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组精子数量和精子活力均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠睾丸病理形态的影响（×200）

表1 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠睾丸、附睾系数和精子的影响（，n=10）

表1 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠睾丸、附睾系数和精子的影响（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠脏器系数的影响 机体是一个有机的整体，五脏六腑在抵抗外来侵害时都发挥了重要作用，故本实验对其他脏器系数进行了统计。结果如表2，与正常组相比，DES 模型组胸腺、脾脏系数降低（P＜0.01），肾脏系数降低（P＜0.05），肝脏系数升高（P＜0.01）。给药后，生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组肾脏系数以及高剂量组胸腺系数升高（P＜0.05），生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组肝脏系数降低（P＜0.05）。

表2 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠脏器系数的影响（，n=10）

表2 杜仲补天素胶囊对生精障碍小鼠脏器系数的影响（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 杜仲补天素胶囊对小鼠血清中性激素水平的影响 生殖功能的正常运转离不开体内性激素的调节。ELISA 结果如表3 所示，与正常组相比，DES 模型组E2、T 水平降低（P＜0.05），FSH、LH 水平升高（P＜0.05）。给药后，生精胶囊组E2 水平升高（P＜0.01），杜仲补天素胶囊高剂量组水平升高（P＜0.05）；生精胶囊组T 水平升高（P＜0.05），FSH 水平降低（P＜0.05）。

2.5 杜仲补天素胶囊对小鼠原代肾细胞凋亡的影响 正常数量的肾脏细胞是维持肾脏功能的必要保证，一旦肾脏细胞出现过度凋亡则会严重影响肾脏功能，流式细胞术则是检测细胞凋亡的常用手段。结果如图2 显示，与正常组相比（3.1%），DES 模型组的细胞凋亡率升高（11.3%；P＜0.01），给药后，生精胶囊组和杜仲补天素胶囊低、高剂量组细胞凋亡率均降低（8.3%、8.5%、7.0%；P＜0.05）。

2.6 杜仲补天素胶囊对小鼠肾脏组织中氧化应激指标的影响 正常状态下，体内氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态。病理状态时，体内会产生大量自由基，平衡被打破，机体将产生氧化应激反应。本实验采用试剂盒检测体内氧化系统MDA 以及抗氧化系统SOD 与GSH-Px 水平，结果如表4，与正常组相比，DES 模型组小鼠肾脏组织中MDA 水平升高（P＜0.01），GSH-Px 活性极显著降低（P＜0.01）。给药后，生精胶囊组小鼠肾脏组织中MDA 水平降低（P＜0.01），杜仲补天素胶囊高剂量组肾脏组中MDA 水平降低（P＜0.05）；生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组肾脏组织中GSH-Px 活性升高（P＜0.01），低剂量组GSH-Px 活性显著升高（P＜0.05）。

表3 杜仲补天素胶囊对小鼠血清中性激素水平的影响（，n=10）

表3 杜仲补天素胶囊对小鼠血清中性激素水平的影响（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2 杜仲补天素胶囊对小鼠原代肾细胞凋亡的影响

表4 杜仲补天素胶囊对小鼠肾脏组织中氧化指标的影响（，n=10）

表4 杜仲补天素胶囊对小鼠肾脏组织中氧化指标的影响（，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.7 杜仲补天素胶囊对小鼠原代肾细胞ROS 水平的影响 ROS是机体内主要的氧化系统，本实验同时采用流式细胞术对原代肾细胞中ROS 水平进行了检测。结果如图3，与正常组相比（17.9%），DES 模型组细胞内ROS 水平极显著升高（60.9%；P＜0.01），给药后，生精胶囊组和杜仲补天素低、高剂量组均极显著降低其ROS 水平（35.8%、38.9%、26.0%；P＜0.01）。

图3 杜仲补天素胶囊对小鼠原代肾细胞ROS 水平的影响

图4 杜仲补天素胶囊对小鼠肾脏中TLR4、MyD88 蛋白表达的影响

2.8 杜仲补天素胶囊对小鼠肾脏中TLR4、MyD88 蛋白的表达结果 体内TLR4-MyD88 信号通路的激活参与到体内ROS 的释放，本实验对此通路也进行了检测。结果如图4，Western blot 结果显示，与正常组相比，DES 模型组TLR4和MyD88 蛋白表达水平均升高（P＜0.01），给药后，生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组小鼠肾脏中TLR4 蛋白表达水平降低（P＜0.01），低剂量组小鼠肾脏中TLR4 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；生精胶囊组和杜仲补天素胶囊低、高剂量组MyD88 蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，随着环境污染的加重以及生活压力的增加，男性不育症的发病率明显上升，严重影响男女关系和家庭稳定。DES 作为一种合成雌激素，能够诱发雄性生殖系统疾病，也常作为研究环境内分泌干扰素对雄性个体生殖毒性的模型药物。肾是人体内重要脏腑之一，中医认为，肾藏先天之精，主生殖，为人体生命之本原，故称肾为“先天之本”［10］；肾藏精，主蛰，又称为“封藏之本”。根据“肾主生殖”理论，肾精充足、肾气旺盛，则生殖功能正常；肾精不足、肾气亏虚，则生殖功能异常。研究发现，具有温补肾阳、填精补血功效的右归胶囊可直接作用于睾丸曲细精管，保护生精细胞，促进精子的发生和发育［11］；中药复方制剂温阳生精汤具有温补肾阳的功效，能显著提高肾阳虚雄性不育大鼠血清中睾酮水平，增加精子数量，达到治疗男性不育的目的［12］；金匮肾气丸能通过调控肾阳虚证大鼠生精细胞Bax 和Bcl-2 的表达，抑制生精细胞凋亡，保护生殖能力［13］。生精胶囊含有鹿茸、人参、菟丝子、淫羊藿等多种中药制成的现代中药制剂，具有补肾生精、滋阴壮阳的功效，临床多用于治疗男性不育症，故选用生精胶囊作为本实验的阳性药。而杜仲补天素胶囊也含有杜仲、菟丝子、肉苁蓉、当归等多种具有补肾的中药，其是否对生精障碍起治疗作用，则是本次实验的研究重点。

实验结果显示，与正常组相比，己烯雌酚使小鼠丸曲细精管间隙增大，细胞排列疏松，生精细胞层次不明且数量减少；睾丸、胸腺、脾脏、肾脏系数以及精子数量和精子活力显著下降，肝脏系数显著上升；E2、T 水平显著降低，FSH、LH 水平显著升高。给药后，与DES 模型组相比，杜仲补天素胶囊低、高剂量组曲细精管结构与正常组接近，管间间隙减小，细胞排列稍紧密，高剂量尤为突出；生精胶囊组和杜仲补天素高剂量组精子数量、精子活力以及胸腺、肾脏和睾丸系数显著上升，肝脏系数显著降低；血清中E2 水平显著上升。表示杜仲补天素胶囊对DES 诱导的生精障碍有缓解作用，且高剂量效果较为显著。故本实验通过进一步检测原代肾细胞凋亡和ROS 水平、肾脏组织中氧化应激水平以及TLR4、MyD88 蛋白表达水平，从而探讨杜仲补天素胶囊对小鼠生精障碍的作用机制。

中医学认为“肾为先天之本”，机体的生殖发育以及与生殖发育相关的各种生命活动都由肾所主，故生殖损伤对肾有着不可忽视的影响。流式细胞术检测原代肾细胞凋亡率结果显示，DES 模型组细胞凋亡率极显著升高，给药后，生精胶囊组和杜仲补天素胶囊组细胞凋亡率均显著降低。说明杜仲补天素胶囊对己烯雌酚诱导生精障碍小鼠的肾脏损伤有明显改善作用，为探究其作用机制，我们进一步对肾脏组织中相关指标进行检测。

活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）是指生物体在有氧代谢条件下产生的含氧自由基。正常状态下，体内ROS 和抗氧化物质处于动态平衡状态。病理状态时，机体会产生大量ROS，平衡被打破。当ROS 水平超过机体自身抗氧化能力时，机体将产生氧化应激［14］。MDA 是脂质过氧化反应过程的最终产物，可以通过与核酸分子中的氨基或蛋白质等发生反应，形成MDA 介导的聚合分子，会对机体造成损伤，因此，检测MDA 水平能够反映脂质过氧化程度，从而反映细胞受损的程度［15］。GSH-Px 是一种过氧化物分解酶，能够有效清除活性氧，终止自由基的反应［16］，从而保护机体。研究发现，DES 可通过降低机体内氧化应激水平，从而引起生殖功能损伤［17］，另有研究表明，氧化机制是DES 导致生殖障碍的一个重要作用机制［18-19］。流式细胞术检测原代肾细胞ROS 水平结果显示，DES 模型组原代肾细胞ROS 水平极显著上升，给药后，生精胶囊组和杜仲补天素组ROS 水平极显著降低。氧化应激指标检测结果显示，DES 模型组肾脏组织中MDA 水平极显著上升，GSH-Px 水平极显著下降，给药后，生精胶囊组和杜仲补天素胶囊高剂量组MDA 水平显著降低，GSH-Px 水平显著上升。提示杜仲补天素胶囊可能通过提高抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化物的产生，缓解肾脏损伤，从而改善小鼠生精功能障碍。研究发现，TLR4/MyD88/信号通路参与氧化应激反应［20］，故本实验进一步探讨杜仲补天素胶囊对小鼠生精障碍的缓解作用是否与TLR4-MyD88 信号通路有关。

Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一种分布广泛的模式识别受体［21］，在免疫应答和炎症反应过程中发挥重要调控作用。MyD88 是TLR4 通路中下游主要的接头蛋白，在体内其他炎症通路中，也起着重要作用［22］。TLR4 通过激活MyD88，从而活化核转录因子NF-kB，促进炎症因子表达，进而引起肾脏损伤。WB 结果显示，DES模型组肾脏组织中TLR4 和MyD88 蛋白表达水平显著升高，激活了TLR4 通路，而生精胶囊和杜仲补天素胶囊可显著降低TLR4 和MyD88 蛋白表达水平。提示杜仲补天素胶囊可能通过抑制TLR4/MyD88 通路，缓解肾脏炎症反应，从而达到调节小鼠生精功能障碍的作用。

综上所述，杜仲补天素胶囊对己烯雌酚诱导的雄性小鼠生精障碍具有一定的改善作用，其可能与降低肾脏氧化应激水平及抑制TLR4/MyD88 信号通路有关。环境雌激素导致的男性生殖障碍发病率逐年升高，随着杜仲补天素胶囊作用机制的进一步研究，杜仲补天素胶囊在生精障碍的治疗方面将具有良好的应用前景。