林辉焕，蔡展帆，章锦涵，张佩霞，熊 欣，周忆莲，梁旭霞

（广东省食品检验所，广东 广州 510435）

砷是一种广泛存在于自然界、与人类生活密切相关、在水和食物中常见的非金属元素［1］，其常见形态有亚砷酸［As（III）］、砷酸［As（V）］、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）砷胆碱（AsC）、砷甜菜碱（AsB）等，对人体的毒害作用依次减弱［2-3］，被认为与免疫系统功能性障碍、癌症、皮肤病、心血管疾病等相关联［4-5］。无机砷及其化合物已被确认为一类致癌物质［6-7］，其毒性与元素存在形态密切相关，故确定各种砷形态的含有量来评价被测试物的毒性更科学［8］。

灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质和保健作用，其药用价值日益受到重视，具有增强机体免疫力、抑制肿瘤、修复肝损伤、防护辐射损害等作用［9-12］，具有很大的药用价值。但目前各国对中草药的进出口控制均以总砷含有量限值作为指标，影响了其推广应用，故分析市售灵芝孢子粉中的砷及其形态，特别是高毒性的无机砷含有量，对正确评估其安全性具有非常重要的意义。

目前，砷形态分析方法主要采用液相色谱、电感耦合等离子体质谱仪或原子荧光光谱仪测定的联用技术［13-16］。本实验采用我国自主研发的原子荧光光谱仪与液相色谱联用（LC-AFS）技术考察灵芝孢子粉中的砷形态，以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Elspe-2 元素形态分析仪（广州谱临晟仪器有限公司）；AFS-8230 原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）；DHG-9145A 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Allegra 64R 台式冷冻离心机（美国Beckman 公司），HQlld 数显PH 计（美国Hach 公司）。PRPX-100 阴离子交换柱（瑞士Hamilton 公司）；OWT203阴离子交换色谱柱（广州谱临晟科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 LC-AFS 条件

2.1.1 元素形态分析仪 分离柱Hamilton PRPX-100 阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；保护柱Hamilton PRPX-100 阴离子交换柱（10 mm×4.1 mm，10 μm）；流动相15 mmol/L磷酸二氢铵（pH6.0）；体积流量1.2 mL/min；进样量100 μL。

2.1.2 原子荧光光谱仪 负高压270 V；As 灯电流60 mA；载气高纯氩气；载流5% 盐酸；还原剂0.5% 氢氧化钾/1.5%硼氢化钾溶液。

2.2 标准溶液制备 精密称取一甲基砷、二甲基砷、三价砷、五价砷适量，分别置于100 mL 量瓶中，1% 硝酸稀释至刻度，摇匀，作为贮备液（1 mg/L），各精密量取适量，置于同一100 mL 量瓶中，水稀释至刻度，摇匀，即得（1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、50.0 μg/L）。

2.3 色谱柱筛选 本实验考察Hamilton PRPX-100、谱临晟OWT203 阴离子交换柱对4 种砷形态的分离效果，结果见图1。由此可知，2 种型号色谱柱均能较好分离砷形态，但出峰顺序有所不同，可能与两者所使用柱填料不同造成的；OWT203 柱分离时间较短，310 s 内即能完全洗脱出来，而Hamilton PRPX-100 柱需要420 s，但后者峰型较好，没有拖尾现象，出峰受提取溶剂的影响较小。因此，选择Hamilton PRPX-100 阴离子交换柱进行实验。

图1 各砷形态色谱图

2.4 样品前处理

2.4.1 提取方式、提取溶剂筛选 本实验选取总砷含有量较高（0.37 mg/kg）的市售灵芝孢子粉，分别在90 ℃加热、常温超声条件下考察1%硝酸、1%乙酸、1%盐酸、超纯水对4 种砷形态的提取效果，结果见图2。由此可知，90 ℃加热时的提取效率优于常温超声，并且以1% 硝酸为溶剂时提取率最高，达77.4%（以无机砷为主），其次是1%盐酸；在常温超声时，1% 盐酸提取效率最高，其次是1%乙酸。

图2 提取方式、提取溶剂对4 种砷形态提取效果的影响

2.4.2 提取时间筛选 根据“2.4.1”项下结果，本实验分别选择在90 ℃加热时提取效率最高的1%硝酸，以及在常温超声时提取效率最高的1% 盐酸，考察提取时间1、1.5、2、2.5 h 对4 种砷形态提取率的影响，结果见图3。由此可知，在90 ℃加热时提取率随着时间延长而升高，在2 h 时达到最大值（78%），2.5 h 后基本不变；在常温超声时提取率随着时间延长而有所波动，但整体上都不高，在30%～40%之间。

图3 提取时间对4 种砷形态提取效果的影响

2.4.3 处理方法 取适量孢子粉（胶囊去除外壳），混匀后称取0.5 g，置于15 mL 离心管中，加入10 mL 1%硝酸，置于90 ℃烘箱中放置2 h，每隔15 min 取出振摇1 次，提取完成后取出，冷却至室温，8 000 r/min 离心5 min，倒出上清液并加入10 mL 正己烷，振摇充分以除去脂肪，8 000 r/min离心10 min，注射器吸取部分下层清液，0.45 μm微孔滤膜过滤。取滤液过C18小柱（先用10 mL 甲醇过滤，再用20 mL 超纯水过滤，活化静止30 min），收集续滤液，过2 μm 滤膜，上机分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 按“2.2”项下方法制备标准溶液，在“2.1”项条件下进样测定。以溶液质量溶度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各砷形态在各自范围内线性关系良好。

配制系列低质量浓度（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/L）的混标溶液，在“2.1”项条件下进样测定，根据信噪比（S/N）≥3 确定检出限。结果，各砷形态在0.2 μg/L 下时S/N 仍大于3，说明检出限是低于0.2 μg/L的。

表1 各砷形态线性关系

2.5.2 精密度试验 取市售样品，加入低、中、高质量浓度标准溶液，平行6 份，在“2.1”项条件下进样测定，结果见表2，可知RSD 均小于7%，表明仪器精密度良好。

表2 各砷形态精密度试验结果（n=6）

2.5.3 加样回收率试验 取市售样品进行加样回收率试验，平行3 次，结果见表3。由此可知，相对于As5+，As3+回收率整体上较高，可能是因为两者会互相转化，但无机砷总量回收率在合理范围内。

表3 各砷形态加样回收率试验结果（n=3）

2.6 样品含有量测定 取6 种样品，按上述优化条件进行分析，计算含有量，结果见表4。由此可知，砷形态以无机砷为主，DMA、MMA 仅分别在1 种样品中被检测出，其中有3 种无机砷含有量达到或略高于食品安全国家标准GB 2762—2017 《食品中污染物限量》中的稻谷、糙米、大米限量（0.2 mg/kg），但低于GB 16740—2014《食品安全国家标准 保健食品》总砷限量（1.0 mg/kg）。

3 讨论

本实验确定灵芝孢子粉最优提取方法为样品加入1%硝酸，在90 ℃下加热提取2 h（每隔15 min 振摇1 次）。在应用LC-AFS 法分析其中4 种砷形态时，以15 mmol/L 磷酸二氢铵（pH6.0）为流动相等度洗脱，可保证结果准确性，仅8 min 即可完成检测，而且该方法具有检测成本低、灵敏度高、检出限低等优点。

表4 各砷形态含有量测定结果

灵芝孢子粉服用剂量为6～8 g/d，本实验测得其中无机砷最高质量分数为0.381 mg/kg，即每天摄入量为2.28～3.04 μg。联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会（JECFA）暂定，无机砷的可耐受摄入量为每天2.14 μg/kg，即成年人（体质量60 kg）每天允许摄入128.4 μg。由此可知，灵芝孢子粉中无机砷含有量在可接受暴露量范围内。

另外，以总砷含有量为指标来衡定药用砷暴露量时，会夸大无机砷暴露量。因此，有必要建立药用灵芝孢子粉中无机砷的提取和测定方法，以完善砷毒性评价手段，有效规范市售药粉质量，从而保障服用者的健康。