李 杰，尚孟文，李婼楠，吴艳芳

（河南科技大学医学院，河南 洛阳 471023）

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其味苦，性寒，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效，主要活性成分是以黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素为代表的黄酮类物质，有着抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化等多种生物活性［1］。目前，用于提取黄芩中上述黄酮的溶剂主要有水［2］、甲醇［3］、乙醇［4］、离子液体［5］，其中水提符合中药传统使用方法，其廉价易得、无毒、无污染，但产物得率低，能耗高，会造成资源浪费，故建立一种环保、高效、简便的提取工艺具有一定现实意义。

水热法提取具有绿色环保、操作简便等优点，该方法主要是利用一定的水热温度和压力来使植物细胞壁裂解或水解，减小溶剂渗透、扩散到细胞内部的阻力，从而使细胞内的天然产物活性组分能高效、快速的溶出。王星敏等［6］应用水热法提取桑叶中异槲皮苷，发现它可加快木脂素中苯丙基C-O-C、C＝C 结构的分解，提高了该成分得率；Sato 等［7］将其应用于咖啡生豆中抗氧化物质的提取，发现提取液可用于保健品、运动饮料；Gao 等［8］通过上述方法提取种茶108 中的多糖，发现它不会影响该成分生物活性，另外该技术还可用于β-葡聚糖［9］、苹果酸［10］、半纤维素［11］等天然活性物质的提取，显示出广阔的应用前景。但目前关于水热法在中药材活性物质提取方面的研究还鲜见报道，故本实验采用该方法提取黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素3 种黄酮类物质，并对其进行优化，以期为其他中药材有效成分的提取提供新思路。

1 材料

LC2000 液相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司）；ELx800 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；BT125D 双量程电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ2200D 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CT14RD 高速离心机（上海天美生化仪器设备有限公司）；聚四氟乙烯内衬、不锈钢反应釜（郑州博科仪器设备有限公司）；PHG9246A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。黄芩（洛阳同仁堂药店）经河南科技大学李艳教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素对照品（国家标准物质中心）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；体积流量1.0 mL/min；柱温室温；检测波长275 nm；进样量20 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷对照品6.0 mg，黄芩素对照品5.0 mg，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇溶解，分别移取5、2.5、2.5 mL 至25 mL 量瓶中，50%甲醇定容，得到贮备液，精密吸取1.0、1.5、2、2.5、3 mL 于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末1.0 g（过60 目筛）、纯净水40 mL，一同置于聚四氟乙烯内衬的反应釜内，搅拌均匀后密封，在110 ℃下提取15 min，取出，自然冷却至室温，移取提取液2 mL 至离心管中，10 000 r/min 离心5 min，取1 mL 上清液于100 mL 量瓶中，50% 甲醇定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 专属性试验 取对照品、供试品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，2种溶液中各成分在相同保留时间处均有吸收，分离度大于1.5，理论塔板数大于6 000，峰形对称，杂质峰对检测无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.6 方法学考察 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定5 次，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积RSD 分别为1.22%、0.96%、1.31%，表明仪器精密度良好。取供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得3 种黄酮峰面积RSD分别为1.09%、1.12%、1.26%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。平行制备5 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得3 种黄酮含有量RSD 分别为2.04%、1.83%、1.74%，表明该方法重复性良好。同时，3 种黄酮平均加样回收率分别为99.5%、103.1%、98.3%，RSD 分别为2.1%、2.9%、3.6%。

2.7 总得率测定 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下方法计算3 种黄酮含有量，测定总得率Y，公式为Y＝（C1+C2+C3）×V×N/（M×1 000），其中C1、C2、C3分别为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素含有量（μg/mL），V为提取溶剂体积（mL），N为稀释倍数（倍），M为药材质量（g）。

2.8 单因素试验

2.8.1 液料比 固定提取温度110 ℃、提取时间15 min，考察液料比对3 种黄酮总得率的影响，结果见图2。由此可知，总得率随液料比增加而逐渐升高，在40∶1 时达到最大值，这是因为液料比增加在一定程度上提高了提取体系内的压力与固液之间的接触面积，并且压力升高有利于植物细胞壁破碎［12］，而且接触面积增加可扩大固液间黄酮浓度差［13］，两者协同作用使黄酮能够快速溶出，从而提高提取效率；超过40∶1 时总得率趋于稳定，但提取液中黄酮含有量反而降低，导致后续纯化、浓缩成本增加。因此，选择液料比为40∶1。

图2 料液比对3 种黄酮总得率的影响

2.8.2 提取时间 固定提取温度110 ℃、液料比40∶1，考察提取时间对3 种黄酮总得率的影响，结果见图3。由此可知，提取时间超过15 min 后总得率开始降低，这是因为在水热提取过程中纤维素、半纤维素的长链分子转化为可溶性的低聚糖、单糖等小分子，木脂素转化为较低分子的酚类单体或多聚体［6］，从而使植物细胞壁遭到破坏，有利于降低水分子进出细胞的阻力，促进黄酮溶出而提高其得率；但提取时间过长会导致黄酮结构发生变化或分解［14］，导致其得率反而降低。因此，选择提取时间为15 min。

图3 提取时间对3 种黄酮总得率的影响

2.8.3 提取温度 固定液料比40∶1、提取时间15 min，考察提取温度对3 种黄酮总得率的影响，结果见图4。由此可知，随着提取温度增加总得率升高，在110 ℃时达到最大值，这是因为在此温度下水由常态转化为亚临界态，其理化性质发生了突变，如水分子极性和水分子簇变小、介电常数降低等，有利于提高黄酮在水中的溶解性和水分子进出细胞的交换速率［15］，同时温度升高也可使提取体系内的自生压力增加，有助于细胞壁破裂、黄酮溶出；但超过110 ℃时总得率反而降低，可能是由于温度过高导致溶出的黄酮分解。因此，选择提取温度为110 ℃。

图4 提取温度对3 种黄酮总得率的影响

2.9 响应面法 在单因素试验的基础上，以液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）为影响因素，3 种黄酮总得率（Y）为评价指标，通过Design-Expert 8.0.6.1 软件设计三因素五水平试验，优化水热法提取工艺。因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

通过Design-Expert 8.0.6.1 软件对表3 数据进行拟合，得到二元多项回归方程为Y＝163.10+5.39A-4.71B+9.808C+21.24AB-8.39AC+5.14BC-24.23A2-20.06B2-16.52C2，方差分析见表4。由此可知，模型具有高度显著性（P＜0.000 1）；失拟项F值为3.32，P＝0.107 2＞0.05，表明模型可较好地描述各因素与响应值之间的关系；决定系数R2、校正系数分别为0.983 8、0.969 2，表明模型拟合度良好，可信度较高，可用于分析预测［16］；变异系数为4.92%，表明模型具有理想的精密度和可靠性［17］；各因素及其二次项、交互项均有显著影响（P＜0.05），表明它们之间不是简单的线性关系，影响程度依次为C（提取温度）＞A（液料比）＞B（提取时间）。

表4 方差分析

由响应面分析可知AB交互效应最显著，其次是AC，BC最弱，与表4 结果吻合，同时随着各因素的增加，相应响应值先升后降。通过Design Expert 8.0.6.1 软件进行分析，得到最优条件为液料比40.35∶1，提取时间14.68 min，提取温度112.79 ℃，总得率165 mg/g。

为了方便操作，将优化工艺修正为提取温度113 ℃，提取时间15 min，液料比40∶1，同时与文献［18］报道的最优水煎煮工艺（提取时间50 min，液料比25∶1，提取次数2 次）进行比较，结果见表5。由此可知，本实验所得工艺稳定可靠，而且水热法提取效果优于水煎煮法，可能是由于水热法是在较高温度、压力下进行的，可使植物细胞壁被充分破坏，减小了黄酮溶出阻力，从而使其得率增加。

响应面分析见图5。

表5 验证试验结果（n=3）

3 讨论与结论

图5 各因素响应面图

目前，提取黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的常用溶剂主要为水、甲醇、乙醇、离子液体，其中水提存在时间长、得率低、能耗高等不足；甲醇提取有一定的毒性，与中药绿色环保的理念相悖；乙醇提取虽然无毒，但其回收需蒸馏、分馏等操作，后处理较为繁琐；离子液体提取制备过程繁琐，成本高，难于工业化生产。鉴于此，本实验对水热法提取黄芩中上述3 种黄酮的可行性进行了研究，发现该方法提取效果较理想，通过响应面法优化得到最优工艺为液料比40∶1，提取时间15 min，提取温度113 ℃，3 种黄酮总得率为161 mg/g，与预测值165 mg/g接近，表明该方法合理可靠，可有效减少操作随机性和盲目性。