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ELISA 法快速检测中药材黄曲霉毒素总量

2020-10-14赵新悦毛雯雯王亚冬张东浩张兰兰

中成药 2020年9期
关键词:柏子仁桃仁酸枣仁

刘 蕊 ,赵新悦,毛雯雯,王亚冬,冯 红,张东浩,张兰兰*

(1.河北大学药学院,河北 保定 071028;2.数字本草检测科技有限公司,天津 300400)

随着中医药的发展,中药材的安全问题也越来越被人们关注。对于部分种子类、果实类、动物类及少数根茎类药材,由于在加工、贮藏过程中易产生霉变,极易被黄曲霉毒素污染。2010 年版《中国药典》规定了酸枣仁、僵蚕、胖大海、陈皮、桃仁共5 种药材黄曲霉毒素的限度标准;2015 年版《中国药典》,进一步对决明子、远志等14 种易受黄曲霉毒素污染的药材和饮片增加了检查项目和限度标准。随着国家标准对安全指标控制的加强,黄曲霉毒素的检测方法得到了广泛研究[1-7]。

2015 年版《中国药典》共收录2 种黄曲霉毒素测定方法,一种为高效液相色谱-柱后衍生法,采用荧光检测器;当测定结果超出限度时,需采用第二种,即高效液相色谱串联质谱方法进行确认[8]。这2 种检测方法具有特异性强、定量准确等优点,但所需仪器昂贵、样品处理过程繁琐、试剂及对照品毒性强、污染大,并且需要专业的技术人员才能实现检测。对于中药材的采收、加工、流通、仓储等环节,无法满足快速检测的需求。因此需要开发简单、便捷、即时、准确、高效、节能的快速检测技术方法用于中药材安全控制。

ELISA 快速检测方法即将黄曲霉毒素的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该方法具有操作简单、费用少、样品量少等优点,已在食品、饲料检测中广泛应用。王彤颖等[9]利用ELISA 法测定金银花、胖大海、远志的黄曲霉毒素B1 的含有量,其检测结果与HPLC 检测结果基本一致。林方芬等[2]通过ELISA 检测方法检测30 种中药饮片中黄曲霉素B1的含有量。虽然黄曲霉毒素B1 有少量ELISA 检测方法报道,但尚未见黄曲霉毒素总量ELISA 检测方法的研究报道。

本研究建立中药材的黄曲霉毒素总量ELISA检测方法并对麦芽、酸枣仁、柏子仁、桃仁、远志、决明子等6 种中药材黄曲霉毒素总量的前处理方法进行探讨,以期ELISA 检测方法能够运用到更多中药材的黄曲霉毒素检测中。

1 材料

EPOCH 型酶标仪(美国博腾公司);U3000 型高效液相色谱仪、U3000 型荧光检测器(美国赛默飞世尔公司)。黄曲霉毒素总量抗原(深圳幂次方生物科技有限公司);黄曲霉毒素总量抗体(哈尔滨进万康生物科技有限公司);黄曲霉毒素总量对照品(青岛普瑞邦生物工程有限公司);山羊抗小鼠IgG-HRP(北京康为世纪生物科技有限公司);TMB(北京索莱宝科技有限公司);黄曲霉毒素总量免疫亲和柱(青岛普瑞邦生物工程有限公司)。甲醇(天津康科德化学试剂公司);磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液(CBS)(实验室自制);水为超纯水。

酸枣仁、桃仁、麦芽、远志、决明子、柏子仁样品,均购买自河北安国市场,经数字本草检测科技有限公司张兰兰研究员鉴定为正品。

2 方法

2.1 间接竞争ELISA 方法建立 参考文献[10]方法,用CBS 将抗原1∶8 000 稀释,每孔100 μL包被在聚苯乙烯酶标板上,37 ℃孵育2 h,用PBST 洗板5 次;以每孔100 μL 0.5% 脱脂奶粉37 ℃封闭1 h,用PBST 洗板3 次;每孔依次加入40 μL 经PBS 稀释的不同浓度的黄曲霉毒素总量(AFs)对照品溶液和60 μL 适当浓度的酶标抗原,37 ℃孵育1 h,用PBST 洗涤3 次;以每孔100 μL加入山羊抗小鼠IgG-HRP(用PBS 1∶10 000 稀释),37 ℃孵育1 h,PBST 洗板3 次;每孔加入100 μL TMB 溶液,37 ℃孵育30 min,用酶标仪测定450 nm 吸光值,建立间接竞争酶免疫分析法。抑制率=(A阳性对照孔-A阴性对照孔/A阳性对照孔)×100%。

2.2 间接竞争ELISA 方法学考察

2.2.1 ELISA 条件优化 包被液选择,CBS、PBS、Tris-HCl、醋酸盐缓冲液稀释包被原进行抑制实验;封闭液选择,选择1% BSA、0.5%脱脂奶粉、1%酪蛋白作为封闭液进行封闭,进行抑制实验;包被方式优化,分别选择37 ℃孵育1、2、3 h和4 ℃过夜方式作为包被方式,进行抑制实验;竞争反应时间选择,分别选择竞争时间为30 min、1 h、2 h 做为竞争反应时间,进行抑制性实验;显色时间选择,分别选择显色时间为10、20、30、40 min 为显色反应时间,进行抑制性实验;离子强度选择,分别制备含有 0.1、0.05、0.01、0.005 mol/L PBS,调pH 至7.4,以此稀释黄曲霉毒素总量对照品溶液和抗体进行抑制实验。

2.2.2 线性关系考察 以PBS 配制200 ng/L 黄曲霉毒素总量为母液,2 倍逐级稀释到6.25 ng/L,以黄曲霉毒素总量质量浓度对数值为横坐标(X),抑制率为纵坐标(Y)进行回归。

2.2.3 精密度试验 制备100、80、60、40、20、10 ng/L 黄曲霉毒素总量对照品溶液,间接竞争ELISA 方法检测其抑制率,每个孔3 个平行,比较每孔差异,计算RSD 值。连续3 d 检测6 个质量浓度的抑制率,比较每孔差异,计算RSD 值。

2.2.4 特异性试验 将不同浓度的呕吐毒素、赭曲霉毒素A、伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮用PBS稀释到不同质量浓度用于替代黄曲霉毒素总量对照品溶液,应用间接ELISA 法测定其线性关系,计算出50%抑制浓度(IC50),并计算交叉反应率。

2.2.5 样品处理

2.2.5.1 麦芽 称取1 g 麦芽样品,于5 mL 70%甲醇溶液中,超声5 min,离心(5 000 r/min)5 min,滤过,吸取1 mL 续滤液溶于9 mL PBS 中,混匀。

1)建立健全节能管理组织机构。集团公司成立了以董事长为组长的节能减排低碳领导小组,设立节能减排办公室作为节能工作的日常管理机构,要求凡是年综合能源消费量1×104t标准煤以上的用能单位须按规定设置专职节能管理人员。各所属单位建立了从公司到班组的三级网络,形成了纵向到底、横向到边、上下联动的管理体制。

2.2.5.2 酸枣仁、柏子仁、桃仁 称取1 g 酸枣仁、柏子仁、桃仁样品,于12 mL 70% 甲醇溶液中,超声5 min,离心(5 000 r/min)5 min,滤过,取上清400 μL 于蒸发皿中,置水浴上挥干,再加4 mL 水复溶,得样品检测液。

2.2.5.3 远志、决明子 称取1 g 未检测出黄曲霉毒素总量的远志、决明子样品,于12 mL 70%甲醇溶液中,超声5 min,离心(5 000 r/min)5 min,滤过,取3 mL 过免疫亲和柱,3 mL 上样,3 mL 水洗,1 mL 甲醇洗脱。取100 μL 洗脱液挥干,加5 mL水中复溶,得样品液。

2.2.6 加样回收率试验 分别空白样品基质中,添加黄曲霉毒素总量对照品溶液,制成含黄曲霉毒素4、2、1 ng/g 的样品,用优化后的ELISA 方法进行检测。

2.3 ELISA 检测结果与HPLC 法比较

2.3.1 样品制备 ELISA 方法供试品溶液按“2.2.5”项下方法制备;HPLC 法供试品溶液制备参考2015 年版《中国药典》方法。

2.3.2 检测方法 ELISA 方法为“2.2.1”项下优化后的检测方法,计算其抑制率代入回归方程,计算黄曲霉毒素总量残留量。HPLC 方法参照文献[11]方法,色谱条件稍有改动,C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);FLD 荧光检测器,激发波长360 nm,发射波长440 nm;流动相甲醇-水(45∶55);体积流量1.0 mL/min;柱温45 ℃;进样量20 μL。

3 结果与分析

3.1 ELISA 方法优化 在其他条件一致的情况下,通过改变反应体系中某一条件,如包被温度、离子强度、pH 等,采用间接竞争ELISA 方法,测定标准曲线并比较IC50值、A0值,优化后的结果见表1。根据优化后的条件,黄曲霉毒素总量回归方程为Y=22.603 ln(X)-22.606,r=0.9902,在6.25~100 ng/L范围内线性关系良好;以抑制率达到50%的所对应的黄曲霉毒素总量值为灵敏度,灵敏度为24.83 ng/L,以抑制率达到10%的所对应的黄曲霉毒素总量值为检出限,检出限为4.23 ng/L。

表1 间接竞争ELISA 测定黄曲霉毒素总量的优化条件Tab.1 Optimization conditions for determination of total aflatoxin by indirect competition ELISA

3.2 精密度试验 板内6 个浓度的RSD 为1.2%~7.0%。板间变异系数RSD 为4.1%~11.8%。可以看出10 ng/L 的标准点波动较大,可能是由于该点接近标准曲线的检测下限,但这种波动并不影响标准曲线稳定性。一般试剂盒的批间检测变异系数在5%~15%是可以接受的,即仪器精密度良好。

3.3 特异性试验 由表2 可知,AFB1 与AFB2、AFG1、AFG2 的交叉反应率在40% 以上,因此该方法为检测黄曲霉毒素总量的方法,玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、伏马毒素B 交叉反应率小于0.01%,表明该抗体特异性好。

表2 不同结构类似物交叉反应结果Tab.2 Results of Cross-reaction with other mycotoxins

3.4 样品处理 本研究以样品空白提取液和0.05 MPBS 溶液作为标准品系数溶液绘制标准曲线,对不同样品基质对标准曲线的影响进行考察,图1 显示,按“2.2.5”项下处理的方法与PBS 稀释标准曲线基本一致。麦芽、酸枣仁、柏子仁、桃仁4 种中药材通过样品稀释可消除基质效应,但远志和决明子药材经过甲醇提取后色素较重,对黄曲霉毒素总量标准曲线干扰较大,提取液经免疫亲和柱净化后,消除了色素影响。酸枣仁、柏子仁、桃仁按麦芽方法处理后也出现对标准曲线干扰的现象,加大稀释倍数后,消除了这3 种药材基质对黄曲霉毒素总量标准曲线的干扰,见图2。

图1 样品与PBS 标准曲线Fig.1 Standard curve of samples and PBS

图2 麦芽处理法样品与PBS 标准曲线Fig.2 Standard curve of Hordei Fructus Germinatustreated samples and PBS

3.5 加样回收率试验 6 种药材黄曲霉毒素的加样回收率结果见表3,其中麦芽的检出限为0.2 μg/kg,桃仁、酸枣仁、柏子仁的检出限为0.5 μg/kg,决明子、远志的检出限为0.8 μg/kg。这6 种药材的平均加样回收率为94.5%~109.5%。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=3)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=3)

3.6 ELISA 检测结果与HPLC 法比较 收集麦芽13 批,酸枣仁10 批,柏子仁、决明子各7 批,桃仁8 批,远志15 批,共计60 批,同时用ELISA 方法和HPLC 法检测黄曲霉毒素。检测结果见表4,偏差在1 ng/g以上的有3 个,分别为b002、y001、y003。产生偏差的原因可能是样品的黄曲霉毒素含有量已经超过本研究建立的标准曲线范围。但通过皮尔森相关系数计算间接ELISA 与HPLC 结果的匹配度为0.998,表明本研究建立的间接ELISA 法测定结果与HPLC 法一致。60 种中药材中检出率最高的为柏子仁,检出率为100%,酸枣仁、桃仁次之,检出率均为50%。

表4 60 批样品2 种方法检测结果(ng/g,,n=3)Tab.4 Results of sixty batches of samples by two methods(ng/g,,n=3)

表4 60 批样品2 种方法检测结果(ng/g,,n=3)Tab.4 Results of sixty batches of samples by two methods(ng/g,,n=3)

注:“-”表示未检出。

4 讨论

随着免疫分析方法的发展,ELISA 在中药材检测方面得到广泛研究[12]。本实验通过优化封闭液、包被液、包被方式、竞争反应时间、显色时间、离子强度因素,建立间接竞争ELISA 法并完成其方法学研究。该方法检测结果与HPLC 法相吻合。

对数字本草检测科技有限公司2017 至2019 年上半年接检黄曲霉毒素残留量测定样品及文献[11-14]报道分析,选择检出率最高的6 种中药材进行ELISA 快速检测方法的摸索。由于6 种中药材的作用基质不同,因此采用了不同的处理方法消除基质对ELISA 方法的影响。

麦芽的基质影响较小,通过甲醇溶液提取、离心、PBS 稀释即可消除。酸枣仁、桃仁、柏子仁基质的影响次之,通过蒸干甲醇提取液,除掉有机溶剂,再用水复溶的方式可消除。决明子、远志由于甲醇溶液提取后,色素较重,仅用蒸干甲醇提取液的方式不能消除基质的影响,因此采用免疫亲和柱进行基质净化。出现不同品种用不同提取方式提取的原因可能为ELISA 法在竞争反应阶段由于中药材基质不同影响了样品和竞争抗原的竞争;中药材经甲醇溶液提取后,提取颜色不一,在竞争反应阶段部分色素聚集到酶标板上,影响了最终的显色反应。

综上,本研究建立了6 种中药材黄曲霉毒素总量间接ELISA 法,该方法与HPLC 法相比具有样品前处理简单、样品量少、检测时间快、经济无污染等特点[15]。本研究建立《中国药典》中规定的6种中药材黄曲霉毒素快速检测试方法,简化了中药材黄曲霉毒素检测过程,降低了检测成本,提高了检测效率;同时为中药材黄曲霉毒素检测提供了新方法,以期为中药材快速检测提供新思路,由此可以开发出更多的中药材快速检测产品,满足中药材多元化检测需求。

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