杨 亮，罗春霞，刘钟山，贺俊妮，杨光勇，关 明*

（1.新疆师范大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.陕西师范大学化学化工学院，陕西 西安 710062；3.新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院，新疆 乌鲁木齐 830011；4.新疆警察学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

大蒜为百合科植物蒜Allium stantivumL.的地下鳞茎，是人们日常生活中常见的药食两用的葱属植物［1］，在当今回归自然，高度重视食品和药品质量安全的潮流中，大蒜由于具有抑菌［2-3］、杀菌［4］、防癌抗癌［5-8］、防治心脑血管疾病［9-10］、提高免疫力等功效［11-13］，成为争相研究的热题。

大蒜中有机硫化合物的存在，是其和其他葱属植物的特征，且不同的葱属植物含有不同的有机硫化合物［14］。完整的大蒜鳞茎中含有蒜氨酸和蒜酶，当大蒜组织被破坏时，蒜氨酸被位于细胞质中的蒜氨酸酶酶解后形成硫代亚磺酸酯。大蒜辣素是大蒜中主要的硫代亚磺酸酯，占大蒜总硫代亚磺酸酯的70%～80%。大蒜辣素等硫代亚磺酸酯是活性分子，根据温度、pH 和溶剂的不同会发生一定数量的转换，生成二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、阿霍烯等不同的有机硫化合物。

目前公认的大蒜的主要功效成分是大蒜辣素。有关大蒜辣素含有量测定的方法有很多，如定硫法、电化学方法、生物检定方法、薄层扫描法、紫外法、气相色谱法［15］等，但都由于各自的缺陷问题而无法得到广泛应用。HPLC 法较为常用，能够准确地测定大蒜辣素的含有量。但是，该法需使用大蒜辣素对照品进行检测，由于大蒜辣素对照品或标准品价格昂贵，需在零下80 ℃储存、运输，且检测时易降解，因而限制了该方法的应用。面对这一问题，目前所报道的最好的解决方式是采用替代对照品法或一测多评法。主要采用性质稳定、廉价易得的化合物作为替代对照品，利用其与供试品溶液中一个待测物或多个待测物之间的恒定响应关系，实现含有量测定。

《欧洲药典》［16］《英国药典》［17］以羟苯丁酯为替代对照品，采用HPLC 法测定了大蒜粉中大蒜辣素的含有量。袁耀佐等［18］参考《欧洲药典》方法，建立以羟苯乙酯为替代对照品的HPLC 法，用于测定鲜蒜中大蒜辣素的含有量，该方法与《欧洲药典》中以羟苯丁酯为替代对照品的方法相比，分析时间明显缩短。

UPLC 法具有分离效率更高、选择性更好、检测灵敏度更高的优势。本实验借鉴前人的研究成果，以羟苯乙酯为替代对照品，建立UPLC 法快速测定大蒜辣素，以期为完善大蒜质量分析方法提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 蒜氨酸对照品（质量分数93.68%，新疆埃乐欣药业有限公司）；羟苯乙酯（质量分数99%，中国食品药品检定研究院）；蒜酶（1 000 U/g，新疆埃乐欣药业有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市福晨化学试剂厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；新鲜大蒜委托乌鲁木齐西八家户路生鲜传奇超市购买，经新疆师范大学关明教授鉴定为葱属植物大蒜Allium stantivumL.的地下鳞茎。

1.2 仪器 Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪、PDA 检测器（美国Waters 公司）；Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm，美国Waters 公司）。色谱图见图1。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

1.3 对照品溶液制备

1.3.1 羟苯乙酯对照溶液 参考文献［19］，精密称取一定量的羟苯乙酯溶解于50%甲醇水溶液中，制备成0.217 6 mg/mL 的羟苯乙酯贮备液。

1.3.2 大蒜辣素对照溶液 参考文献［19］，制备得到564.74 μg/mL 的大蒜辣素溶液。

1.4 色谱条件 Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸水；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长242 nm；进样量1 μL。

1.5 供试品溶液制备 称取2 g 新鲜蒜泥，35 ℃水浴锅放置30 min，先加入10 mL 超纯水低温超声提取15 min，随后加10 mL 甲醇再低温超声提取15 min，将超声后的溶液和0.5 mL 的羟苯乙酯定容于5 mL 量瓶中待测。

1.6 色谱条件优化

1.6.1 检测波长 分别对大蒜辣素、羟苯乙酯对照品溶液进行PDA 光谱扫描，得到光谱图。在波长为210 nm 左右时，2 种化合物的紫外吸收都较大，但波长较低时同样会使样品中杂质的紫外吸收变大，鉴于羟苯乙酯浓度可控，因此以大蒜辣素有较优响应为目的，选择大蒜辣素的特征肩峰242 nm 为检测波长。

1.6.2 流动相 分别选用乙腈与水、甲醇与水、乙腈与甲酸水溶液为流动相，进行测试。结果表明，当以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时，分离效果相对较好，且分析时间较短。在该色谱条件下，大蒜辣素和羟苯乙酯在4 min 内实现基线分离，分离度均大于1.5。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 将“1.3”项下对照品贮备液逐级稀释，按浓度由低到高，在“1.4”项色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表1，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.2 重复性试验 取供试品6 份，按“1.5”项下方法制备供试品溶液，在“1.4”项色谱条件下进样，测得大蒜辣素、羟苯乙酯峰面积RSD 均不大于1.00%，表明该方法重复性良好。

2.1.3 稳定性试验 取同一混合供试品溶液，在“1.4”项色谱条件下，分别于第0、2、4、6、8、10、12 h 进样，记录峰面积。结果表明样品溶液中大蒜辣素不稳定，其在0～4 h 内峰面积RSD 小于2.00%，之后出现明显降解，羟苯乙酯稳定性较好，12 h 内峰面积RSD 0.65%。

2.1.4 加样回收率试验 取供试品按“1.5”项下方法制备供试品溶液，分别向鲜蒜供试品溶液中添加低、中、高3 个浓度水平的大蒜辣素对照溶液，在“1.4”项色谱条件下进样测定，计算得大蒜辣素加样回收率98.83%～100.88%，RSD 远小于15%。

表2 各成分相对校正因子（n=5）Tab.2 Relative correction factors of various constituents（n=5）

2.3 相对校正因子耐用性考察 考察色谱条件的轻微变动对2 种化合物相对校正因子的影响，见表3。结果表明，除检测波长外，其余考察因素的轻微变动对相对校正因子的RSD＜5%。

2.4 相对保留时间校正因子测定 考察色谱条件的轻微变动对相对保留时间校正因子的影响，见表4。结果表明羟苯乙酯对大蒜辣素的相对保留时间为1.49，RSD 为2.27%，故本研究选用相对保留时间作为目标色谱峰的定位指标。

2.5 样品含有量测定 分别以外标法和替代对照品法测定15 个不同产地的新鲜大蒜中大蒜辣素的含有量，结果见表5，将2 种方法的测定结果进行单因素方差分析，分析结果表明，2 种方法测定结果无统计学差异（P＞0.05），且新疆产的大蒜中大蒜辣素含有量普遍高于内地大蒜，其中新疆且末、巴里坤地区的大蒜中大蒜辣素含有量最高。

表3 相对校正因子耐用性考察结果（n=5）Tab.3 Durability results of relative correction factor（n=5）

表4 不同色谱柱、检测波长、体积流量、pH、柱温下相对保留时间（n=5）Tab.4 Relative retention time under different columns，detection wavelength，flow rate，pH and column temperature（n=5）

表5 不同产地样品中大蒜辣素含有量测定结果（n=3）Tab.5 Results of content determination of allicin in samples from different growing areas（n=3）

3 结论

本实验首次建立了一种UPLC 替代对照品法测定鲜蒜中大蒜辣素的方法。该方法样品前处理简单，结果准确可靠，与已报道的HPLC 法相比，极大缩短了样品测定时间，能在4 min 内完成样品测定，有利于对不稳定的大蒜辣素快速检测，与文献［20］报道的UPLC 法相比，该方法不需要大蒜辣素对照品，解决了因大蒜辣素对照品不稳定而测定困难的问题。分别采用外标法和替代对照品法测定了15 个不同产地的鲜蒜中大蒜辣素的含有量，结果表明，2 种方法测得结果无统计学差异（P＞0.05），且新疆产的大蒜中大蒜辣素含有量普遍高于内地大蒜，其中新疆且末、巴里坤的大蒜中大蒜辣素含有量最高。