卢森华，甘洋萦，陆玉丹，杨桂林，林 瑶，曾海生*

（1.玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林 537000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；3.右江民族医学院，广西 百色 533000）

古羊藤Streptocaulon griffithiiHook 为萝藦科马莲鞍属藤本植物，以根入药，又名马莲鞍、藤苦参等［1］。具有清热解毒、散瘀止痛的功效，主要用于治疗湿热腹泻、心胃气痛、感冒发热、跌打损伤等症［2］，是2015 年版《中国药典》收载的傣药“雅叫哈顿散”中的主治药之一［3］，具有较高的药用价值。现代药理学研究表明古羊藤有多种潜在的抗肿瘤、抑菌、抗病毒等活性［4-6］。古羊藤化学成分复杂，从该植物中已分离鉴别出强心苷类、萜类和酚酸类等成分［7-10］，其中强心苷是古羊藤发挥其抗肿瘤作用的重要物质基础［4］，酚酸类化合物有较广泛的抑菌、抗病毒活性［11］。关于古羊藤药材的现行质量标准，仅有广西和贵州的地方中药材标准收载［1］，并且过于简单，仅有性状描述，无含有量测定项，无法有效控制其质量［12］。含有量测定是控制中药质量的有效手段，罗宇东等［13］采用UV 法测定古羊藤中有效成分的含有量，但当前国内外尚无采用一测多评法测定其含有量的报道。一测多评法（QAMS）基于多指标质量控制的研究思路，成为中药及其制剂质量评价的新模式［14］。本实验建立一测多评法测定古羊藤中绿原酸、咖啡酸、4-甲氧基水杨醛的含有量，以期为有效评价和控制古羊藤药材质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 1260 Infinity 型高效液相色谱仪（配置G1311C 型四元泵、G1329B 型进样器、G1 316 A型柱温箱、G1315D 型检测器，美国安捷伦公司）；UltiMate3000 型高效液相色谱仪（配置 HPG-3400SD 四元泵、WPS-3000TSL 进样器、TCC-300SD 柱温箱、DAD-3000RS 检测器，美国赛默飞世尔公司）；XS-205Du 型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-500GDV 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；501型超级恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；Synergy®UV 型超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试剂与药物 古羊藤药材采自广西各地，药材来源主要是采购和野外采集，信息见表1，经玉林市食品药品检验检测中心中药室黎小伟主任中药师鉴定为正品，符合1990 年版《广西中药材标准》项下规定。绿原酸（110753-201415，纯度96.2%）、咖啡酸（110885-200102，纯度100%）、4-甲氧基水杨醛（110790-201404，纯度99.0%）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（优级纯，天津市光复精细化工研究所）；水为超纯水，其他所用试剂均为分析纯。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6×150 mm，5μm）；流动相甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，15.0%A；5～40 min，15.0%～70.0%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；波长230 nm；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取绿原酸对照品11.60 mg、咖啡酸对照品6.72 mg、4-甲氧基水杨醛对照品11.66 mg，分别置于不同的25 mL 量瓶中，加适量甲醇超声（500 W，40 kHz）使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得单一对照品溶液。再分别精密量取上述绿原酸溶液2.0 mL、咖啡酸溶液1.0 mL、4-甲氧基水杨醛溶液0.4 mL，置于同一10 mL 量瓶中并用甲醇定容，即得混合对照品溶液。（每1 mL 混合对照品溶液含绿原酸89.27 μg、咖啡酸26.90 μg、4-甲氧基水杨醛18.47 μg）。

2.2.2 供试品溶液 取古羊藤样品约2 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入80% 甲醇25.0 mL，称定质量，超声（500 W，40 kHz）提取30 min，放冷，用80%甲醇补足减失质量，溶液过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性与专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5 μL，在“2.1”项条件下测定，供试品中相应的色谱峰与绿原酸、咖啡酸、4-甲氧基水杨醛对照品色谱峰保留时间、原始紫外光谱和一阶导数光谱一致，并与其他共存成分的分离度大于1.5，理论塔板数均大于5 000。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL，分别置2.0 mL 量瓶中，加80% 甲醇定容至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液，在“2.1”项条件下分别进样5 μL，以目标峰峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行回归，结果见表2。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.2”项下同一供试品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6 次，测得绿原酸、咖啡酸、4-甲基氧水杨醛峰面积RSD 分别为1.3%、1.4%、1.4%，表明仪器精密度良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验 取S1 号古羊藤样品6 份，每份2 g，精密测定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下分别进样5 μL，测得绿原酸、咖啡酸、4-甲氧基水杨醛含有量RSD 分别为4.8%、2.6%、1.8%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.2.2”项下同一供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于1、2、4、6、12、24 h 进样，测得绿原酸、咖啡酸、4-甲基氧水杨醛含有量 RSD 分别为0.4%、1.1%、0.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已测定含有量的S1号古羊藤样品6 份，每份约1 g，精密称定，另精密称取绿原酸对照品6.90 mg、咖啡酸对照品2.37 mg、4-甲氧基水杨醛对照品2.03 mg，置500 mL量瓶中，加适量80% 甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备液。分别在上述6 份样品中精密加入混合对照品贮备液25 mL，按“2.2”项下方法制备供试品品溶液，在“2.1”项条件下分别进样5 μL，记录各成分峰面积并计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 相对校正因子计算 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，依法测定绿原酸、咖啡酸、4-甲基氧水杨醛的峰面积，以绿原酸为内标，按公式fsi＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci），其中As绿原酸内标峰面积，Cs为绿原酸内标物浓度，Ai为待测成分咖啡酸或4-甲基氧水杨醛峰面积，Ci为待测成分咖啡酸或4-甲基氧水杨醛浓度）计算相对校正因子。结果显示咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子分别为 0.504、0.460，RSD 分别为 0.4%、0.3%，结果见表4。

2.5 系统耐用性考察

2.5.1 进样量 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项条件下分别进样4、5、6 μL，考察不同进样体积对相对校正因子的影响。结果见表5，结果显示，不同进样体积对相对校正因子影响程度不明显，咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子RSD 分别为0.1%、0.09%，相对保留时间RSD 分别为0.03%、0.1%。

表4 各成分相对校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

表5 不同进样量的相对校正因子Tab.5 Relative correction factors of different injection volumes

2.5.2 仪器和色谱柱 选择Agilent 1260 和Ulti-Mate3000 高效液相色谱仪，以及Atlantis®T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，考察不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响。结果见表6，结果显示，不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子影响程度在可接受范围内，咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子RSD 分别为2.3%、3.5%。

表6 不同仪器和色谱柱上相对校正因子Tab.6 Relative correction factors on different instruments and columns

2.5.3 体积流量 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液5 μL，在“2.1”项条件下进样，考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3 个不同体积流量对相对校正因子的影响。结果见表7，结果显示，不同体积流量对相对校正因子影响程度不明显，咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子RSD 分别为0.4%、0.1%，相对保留时间RSD 分别为0.06%、1.0%。

2.5.4 柱温 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液5 μL，在“2.1”项条件下进样，考察20、25、30 ℃3 个不同柱温对相对校正因子的影响。结果见表8，结果显示，不同柱温对相对校正因子影响程度不明显，咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子RSD 分别为0.5%、1.3%，相对保留时间RSD 分别为0.1%、4.6%。

表7 不同体积流量的相对校正因子Tab.7 Relative correction factors of different volume flow rate

表8 不同柱温的相对校正因子Tab.8 Relative correction factors of different column temperature

2.5.5 波长 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液5 μL，在“2.1”项条件下进样，考察228、230、232 nm 3 个不同测定波长对相对校正因子的影响。结果见表9，结果显示，不同测定波长对相对校正因子影响程度不明显，咖啡酸、4-甲氧基水杨醛相对校正因子RSD 分别为1.4%、2.4%，相对保留时间RSD 均为0。

表9 不同测定波长的相对校正因子Tab.9 Relative correction factors of different measuring wavelengths

2.6 色谱峰定位 分别考察相对保留时间在不同仪器、色谱柱中的重复性。结果见表10，结果显示，不同测定波长对相对保留时间影响程度不明显，RSD 分别为0.5%、9.4%，故选择绿原酸作为色谱峰定位指标。

2.7 样品含有量测定 经方法学优化和考察后，采用以上建立的QAMS 法，对11 批样品中咖啡酸、4-甲基氧水杨醛的含有量进行测定，为了考察QAMS 法的准确性［15］，把QAMS 的测定结果与外标法（ESM）测定结果进行了比较。表明所建立的方法具有较好的可信度，结果见表11。

表10 不同仪器和色谱柱上相对保留时间Tab.10 Relative retention time on different instruments and columns

表11 各成分含有量测定结果（μg/g）Tab.11 Results of content determination of various constituents（μg/g）

3 讨论

本实验参考文献［16-18］，分别考察了提取方法（加热回流和超声）、提取溶剂（30%、50%、70%、80%、100% 甲醇）、料液比（15、25、50、100 mL）、提取时间（30、45、60、90、120 min），发现用80%甲醇超声提取30 min 后所得的峰基线平稳，色谱图中检测成分较多且峰形较好。本实验还考察了流动相、色谱柱、柱温、进样量对古羊藤样品溶液分离效果的影响［16-17］。确定“2.1”项下条件。

传统中医的整体观要求对中药材进行多药效成分指标的综合评价［18］。为了确保质量标准中定量指标的正确，通过采用保留时间定性、紫外光谱和一阶导数光谱匹配等方法确证了绿原酸、咖啡酸、4-甲氧基水杨醛存在于古羊藤中。并且绿原酸为古羊藤的重要质量标志物，因此以绿原酸为内标，建立一测多评法测定古羊藤中绿原酸、咖啡酸、4-甲氧基水杨醛的含有量。本实验验证了该方法的精密度、重现性、稳定性、系统适应性和一测多评法的准确性，并对一测多评法的适用性和可行性进行探讨。结果表明，一测多评法推算的含有量与外标法所得含有量没有显著性差异，表明实验建立的相对校正因子具有较好的可信度［19］。

随着一测多评法在《中国药典》中的应用越来越广泛［20］，本实验建立的一测多评方法可对古羊藤进行多药效成分指标的综合评价，以期为建立科学合理的古羊藤质量评价方法，提高其质量控制标准提供参考。