罗心霞，马石楠，周君阳，王 珏，丁 妍，李东升*

（1.湖北医药学院 胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院 基础医学院病理教研室，湖北 十堰 442000）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠状动脉持续性缺血缺氧，导致相应心肌缺血坏死，可并发恶性心律失常、心力衰竭、休克等，严重者可危及生命，是人类死亡的主要原因之一［1］。MI 在大多数发达国家有较高的发病率和死亡率，已成为一个重要的健康问题［2］。氧化应激是心梗后心肌细胞凋亡的重要原因［3］。心肌细胞凋亡参与心肌梗死的发生、发展［4］。心梗后心肌细胞凋亡增加，心脏重塑，最终导致心力衰竭［5］。因此，抑制心梗后氧化应激，减轻心肌细胞凋亡对心梗治疗有重要意义。芪苈强心（Qiliqiangxin，QLQX）是一种特殊的传统中药，具有抑制氧化应激［6］、抑制细胞凋亡［7］等作用。目前国内对该药在心力衰竭作用机制方面研究较多，也有研究发现芪苈强心对心肌梗死有改善作用［8］，而芪苈强心对心梗后细胞凋亡的影响及具体作用机制目前研究较少。

细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk）是内质网膜上一种跨膜信号蛋白，氧化应激时Erk 会自身聚合磷酸化活化，p-Erk调节下游分子发挥抗氧化应激作用。研究发现，核因子 NF-E2 相关因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是p-Erk 的底物［9］。Nrf2 属于CNC（Cap，n，Collar）家族转录因子，是抗氧化应激的核心因子。研究发现Nrf2 及其下游基因通过抗氧化应激对心肌损伤产生保护作用［10］。本研究通过建立小鼠心肌梗死和H9c2 细胞缺氧损伤模型，观察芪苈强心对心梗后细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 芪苈强心胶囊（批号Z20040141）购自石家庄以岭药业股份有限公司，称取芪苈强心胶囊粉末用无菌生理盐水稀释为质量浓度25 mg/mL 溶液，用于小鼠灌胃；称取芪苈强心胶囊粉末用DMEM 完全培养基稀释为质量浓度25 mg/mL 溶液，用于细胞培养。p-Erk 抗体（货号4370S）购自美国Cell Signaling Technology 公司；Erk 抗体（货号AF1051）、Tublin 抗体（货号AF001）购自上海碧云天生物技术有限公司；Nrf2抗体（货 号16396-1-AP）、Bcl-2 抗体（货号12789-1-AP）、Bax 抗体（货号50599-2-lg）购自美国proteintech 公司；DMEM（货号12100046）、胎牛血清（货号16140071）购自美国Gibco 公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（货号A0208）、BCA 蛋白浓度试剂盒（货号P0011）、极超敏 ECL 化学发光显影液试剂盒（货号P0018FM）、Erk 抑制剂PD98059（货号S1805）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 动物与细胞 80 只健康雄性C57BL/6 小鼠，8～10 周，购自湖北医药学院实验动物中心，生产许可证号SCXK（鄂）2016-0008，饲养在湖北医药学院动物实验中心SPF 级动物房中，动物饲养、处理和手术过程由湖北医药学院动物保护与使用委员会审核、批准和监督。H9c2 细胞由湖北医药学院贺细菊老师赠予，在5% CO2、37 ℃饱和湿度的培养条件下培养H9c2 细胞。

2 方法

2.1 造模 将80 只小鼠根据随机数字表法分为假手术组（n＝10）、心肌梗死组（n＝20）、假手术+芪苈强心组（0.25 g/kg）（n＝10）、心肌梗死+芪苈强心组（0.25 g/kg）（n＝20）、心肌梗死+芪苈强心组（0.5 g/kg）（n＝10）、心肌梗死+芪苈强心组（0.75 g/kg）（n＝10）。心肌梗死模型的建立，小鼠前胸部备皮，异氟烷气雾（1.5%～2%）麻醉小鼠。胸骨左缘3～4 肋间开胸，暴露心脏，小心剥离心包，找到左心耳，于左心耳下方约2 mm 处用6～0 眼科带针缝合线结扎左冠状动脉前降支，然后逐层关闭胸腔。假手术组开胸，但不结扎左冠状动脉前降支，其余步骤同手术组。于术后第2天，小鼠灌胃给药，给药28 d。

2.2 组织蛋白的提取 将心脏标本取出后，每10 mg心脏组织加100 μL 的裂解液（含1% PMSF和2%磷酸酶抑制剂）用电动研磨杵匀浆，匀浆后样品置于冰上裂解30 min，每10 分钟涡旋振荡15 s，充分裂解组织细胞。于 4 ℃下，12 000 r/min离心10 min，离心之后取上清液备用。

2.3 超声心动图检测 给药处理28 d 后，异氟烷气雾麻醉小鼠，脱毛膏脱去胸前区毛发，用彩色多普勒超声诊断仪对各组小鼠进行心脏超声心动图检测。用 M 型超声测定左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）。

2.4 细胞处理 取生长状态良好的细胞分为对照组（正常培养）、缺氧组（正常培养液中加入600 μmol/L CoCl2处理12 h）；芪苈强心组（缺氧组基础上加入0.25 mg/mL 芪苈强心预处理24 h）；Erk抑制剂组（芪苈强心组基础上加入Erk 抑制剂20 μmol/L PD98059 处理24 h）。加入含1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）和2% 磷酸酶抑制剂的裂解液（RIPA）100 μL，待细胞充分裂解30 min 后，刮细胞使细胞悬浮，将细胞悬液移入EP 管中，于4 ℃下，12 000 r/min离心10 min，上清即为蛋白样品。

2.5 Western blot 检测 BCA 法测定组织及细胞蛋白浓度。将蛋白样品和SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）按比例混匀，100 ℃变性10 min。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），用湿转法（0.28 mA、90 min）转至PVDF 膜（0.4 nm），5%的脱脂奶粉室温下封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次，10 min/次。室温下孵育二抗2 h，TBST 洗涤3 次，10 min/次。Image Lab 进行显影。Image J 软件进行条带灰度分析。

2.6 RTCA 检测细胞增殖 采用实时无标记动态细胞分析技术。常规培养H9c2 细胞达到对数生长期时用0.25% 胰酶消化，制成单细胞悬液，细胞计数。每孔按3 000 个细胞接种于无菌的细胞增殖孔板（E-plate 16 孔板）中，每孔100 μL 细胞悬液。加入0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL 芪苈强心，并设立对照组，3 个复孔。按照仪器使用说明书，将E-plate 16 孔板放人事先调试好的仪器中培养30 h，自动实时记录细胞增殖情况并绘制曲线。

2.7 统计学分析 采用GraghaPad Prism6 软件对数据进行分析并作图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芪苈强心对心梗小鼠心功能的影响 0.5、0.75 g/kg 芪苈强心对MI 小鼠心功能没有明显改善作用（图1A）；0.25 g/kg 芪苈强心可改善MI 小鼠心功能（图1A～C），而对假手术组小鼠心功能没有影响（图1B～C）。Western blot 检测显示，0.25 g/kg芪苈强心可上调MI 小鼠Bcl-2 表达（P＜0.05，图1D～E），下调Bax 表达（P＜0.05，图1D～E），而0.25 g/kg 芪苈强心对假手术组小鼠凋亡标志物蛋白（Bcl-2、Bax）没有影响（图1D～E）。后续动物实验采用0.25 g/kg 芪苈强心。

图1 芪苈强心对心梗小鼠心功能的影响Fig.1 Effects of QLQX on cardiac function of MI mice

3.2 芪苈强心对心梗小鼠心肌组织细胞凋亡及p-Erk/Nrf2表达的影响 与假手术+生理盐水组相比，心肌梗死+生理盐水组Bcl-2 表达下降（P＜0.05），Bax 表达上升（P＜0.05），与心肌梗死+生理盐水组相比，心肌梗死+芪苈强心组Bcl-2表达上调（P＜0.05），Bax 表达下调（P＜0.05）。p-Erk/Nrf2 信号通路结果显示，与假手术+生理盐水组相比，心肌梗死+生理盐水组p-Erk、Nrf2 表达下降（P＜0.05），与心肌梗死+生理盐水组相比，心肌梗死+芪苈强心组p-Erk、Nrf2 表达上调（P＜0.05）见图2。

图2 Western blot 检测各组小鼠心肌组织蛋白表达（n=3）Fig.2 Detection of protein expression in mouse myocardium by Western blot（n=3）

3.3 芪苈强心对缺氧H9c2 细胞凋亡及p-Erk/Nrf2表达的影响 RTCA 结果结果显示，0.25、0.125 mg/mL芪苈强心对H9c2 细胞生长无抑制作用，细胞毒性较小；而随着药物浓度的增加，芪苈强心（0.5、1.0 mg/mL）对H9c2 细胞增殖的抑制作用增加。因此后续实验选择0.25 mg/mL 芪苈强心，作用H9c2 细胞24 h（图3 A）。Western blot结果显示，与对照组相比，缺氧组Bcl-2 表达下降（P＜0.05），Bax 表达上升（P＜0.05）；与缺氧组相比，芪苈强心组Bax 表达下调（P＜0.05），Bcl-2表达上调（P＜0.05），见图3B～C。芪苈强心预给药与Erk 抑制剂PD98059 同时处理，与芪苈强心组相比，Erk 抑制剂组p-Erk 表达下降（P＜0.05），同时Nrf2，Bcl-2 表达下降（P＜0.05），Bax 表达增高（P＜0.05），见图3D～E。

图3 Western blot 检测各组H9c2 蛋白表达（n=3）Fig.3 Detection of H9c2 protein expression in each group by Western blot（n=3）

4 讨论

心肌梗死是一种严重的心血管疾病，严重危害人类健康［11］。氧化应激是各种有害因素导致活性氧（ROS）产生过多，超过机体的抗氧化能力，引起组织细胞损伤。有研究证实氧化应激反应与心梗的严重程度相关［12］。心肌梗死后，氧化应激增强，导致心肌细胞凋亡、钙超载等一系列病理生理改变［13］。而心肌细胞凋亡可使心室重构，严重影响心功能。因此，抑制氧化应激损伤，减轻心肌细胞凋亡，有利于心梗的治疗。

芪苈强心是由黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮11种中药提取成分组成的传统中药，具有益气温阳、活血通络、利水消肿的功效。方中君药黄芪、附子，益气温阳；臣药丹参活血通络，人参补脾益肺、大补元气，葶苈子泻肺平喘、利水消肿；佐药红花活血化瘀，陈皮理气化痰，泽泻和香加皮强心、利水消肿，玉竹可养心阴；使药桂枝温阳化气。目前对该药在心力衰竭作用机制方面研究较多，有研究发现芪苈强心可抑制氧化应激、抑制细胞凋亡、减轻心室重构［14］。也有研究发现芪苈强心对心梗大鼠有心肌保护作用，但是研究较少，具体机制并不清楚。本研究通过结扎左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型，发现心梗小鼠心脏组织抗凋亡蛋白Bcl-2 表达下降，促凋亡蛋白Bax 表达增高，心肌细胞凋亡增加，而芪苈强心灌胃处理可以上调Bcl-2 的表达，下调Bax 的表达，心肌细胞凋亡减轻，说明芪苈强心可抑制心梗引起的细胞凋亡。

接下来研究芪苈强心减轻心梗引起的细胞凋亡的具体分子机制。Nrf2 是抗氧化应激的核心因子，有抗氧化应激以及维持氧化还原平衡作用，控制一系列抗氧化蛋白和解毒酶的表达［15］。多项研究证明Nrf2 对心肌损伤产生保护作用［16］。在心血管病的动物模型，如心肌缺血再灌注损伤［10］、主动脉弓缩窄术（TAC）引发的心力衰竭［17］中，也得到证实。本实验发现小鼠心梗后心肌细胞凋亡增加，Nrf2 表达下降，考虑小鼠心梗后氧化应激增强，而抗氧化应激核心因子Nrf2 表达下降，小鼠抗氧化应激能力下降，不能对抗心梗引起的心肌损伤，故心肌细胞凋亡增加。而当给予芪苈强心灌胃处理后，Nrf2 表达上升，心肌细胞凋亡减少，说明芪苈强心可上调心梗引起的Nrf2 的下降，使小鼠抗氧化应激能力增强，心肌损伤减轻。无论是在心肌梗死+生理盐水组还是心肌梗死+芪苈强心组，Nrf2与p-Erk 蛋白表达变化趋势一致。

Erk 是内质网膜上一种跨膜信号蛋白，氧化应激时，Erk 会自身聚合磷酸化活化，p-Erk 是Erk的磷酸化形式，具有活性，p-Erk 调节下游分子发挥抗氧化应激作用。Nrf2 是p-Erk 的底物。研究发现［18］活化的p-Erk 会促进Nrf2 与胞浆蛋白Keap1解离，游离的Nrf2 转位入核活化，与核内抗氧化反应原件ARE 结合启动下游抗氧化蛋白的表达从而调控氧化应激。研究发现Erk 信号通路在心脏中有保护作用［19］。芪苈强心可能通过激活p-Erk 的表达，促进抗氧化应激核心因子Nrf2 入核活化，进而启动下游基因表达，从而缓解小鼠心梗后细胞凋亡。体外细胞实验进一步验证了这一猜测。

综上所述，芪苈强心通过激活p-Erk/Nrf2 信号通路发挥抗氧化应激抑制小鼠心梗后细胞凋亡的作用。