关德凤，秦天生，杨永秀，3*

（1.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院妇科，甘肃 兰州 730000；3.兰州大学第一医院妇科，甘肃省妇科肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730000）

宫颈癌（Cervical cancer，CC）是最常见的妇科恶性肿瘤，其发病率和死亡率在女性所有癌症中位列第四［1］。控制肿瘤细胞的恶性增殖并诱发其凋亡是治疗癌症的重要途径［2］。土槿皮乙酸是从土槿皮中分离提取的具有生物活性的二萜类化合物，具有广泛的抗癌作用［3］，可诱发caspases 的激活，引起肿瘤细胞凋亡并有效减弱肿瘤细胞对于化疗的耐药性［4］，但其对宫颈癌的治疗作用及其分子机制尚不明确。PAX2 是PAX 转录因子家族成员之一，在成年个体除在特定组织中表达外几乎被完全沉默，近年来研究显示，PAX2 在多种肿瘤组织中被重新激活并表现出促进癌细胞增殖、迁移的特性［5-6］。Wnt/β-catenin 信号通路在恶性肿瘤中起关键作用［7］，当Wnt 配体和Wnt 通路调节分子突变时导致Wnt 信号异常激活，进而促进CC 细胞的生长和侵袭，研究表明在不同CC 细胞系和活检组织中，Wnt4、Wnt8A、Wnt10B 和Wnt14 相对高表达而Wnt7A 则被强烈下调［8-9］；而抑制Wnt 信号能够不同程度的抑制CC 细胞增殖并促进其凋亡［10］。因此本研究分析了土槿皮乙酸对CC 细胞凋亡、迁移的影响，探究了土槿皮乙酸对PAX2 和Wnt/βcatenin 信号通路的作用，初步阐明土槿皮乙酸通过调控PAX2 对CC 细胞产生影响。

1 材料

1.1 细胞 人CC 细胞Hela、SiHa、CaSki、C33A和MS751 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海）。

1.2 药物与试剂 土槿皮乙酸（美国Sigma 公司，货号L8170）；MTT（北京索莱宝科技有限公司，货号IM0280）；细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公 司，货 号CA1040）；Transwell 小 室（美 国Chemicon 公司，货号ECM550）；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（美国Thermo Fisher 公司，货号11668027）；Matrigel（北京索莱宝科技有限公司，货号356231）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013C）；兔抗BAX 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab32503）；兔抗Bcl-2 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab185002）；兔抗MMP2 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab215986）；兔抗MMP9 多克隆抗体（英国Abcam 公司，货 号ab38898）；兔抗Cyclin D1 单克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab134175）；兔抗Survivin 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab76424）；兔抗PAX2 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab79389）；兔抗βcatenin 单克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab32572）；兔抗p-β-catenin 多克隆抗体（英国Abcam公司，货号ab27798）；兔抗GAPDH 单克隆抗体（美国CST 公司，货号5174）；山羊抗兔IgG H＆L 抗体（英国Abcam 公司，货号ab97051）；Alexa Fluor Ⓒ647 标记的山羊抗兔二抗（英国Abcam 公司，货号ab150083）。

2 方法

2.1 细胞培养 C33A、Hela 和SiHa 细胞采用DMEM 培养基培养，MS751 和CaSki 细胞采用RPMI 1640 培养基培养。培养基中均加入10%FBS、1%青霉素和链霉素。所有细胞在5% CO2、37 ℃下无菌培养。

2.2 MTT 实验 待细胞生长至80%汇合度时，胰蛋白酶消化配制成浓度为1.5×105/mL 的单细胞悬液，以每孔100 μL 接种于96 孔板中，过夜培养后加入不同浓度的土槿皮乙酸（2.5、5、10、20、40 μmol/L）或者0.16% DMSO 分别处理细胞24、48、72 h。处理结束后向培养板中加入新鲜的MTT（5 mg/mL），培养4 h，加入DMSO 进行溶解，在570 nm 波长下检测吸光度值（OD），并计算抑制率和 IC50，抑制率＝［（OD空白组-OD给药组）/OD空白组］×100%。

2.3 shRNA 干扰技术构建PAX2 低表达Hela 细胞株 将PAX2 shRNA 和NC shRNA 序列与Age I 酶切位点一起加入，并在酶消化后与pGC-FU 载体连接。然后将重组质粒转染到HEK293T 细胞中，筛选出阳性细胞，提取质粒。将Hela 细胞接种到6孔板上，根据lipofectamine 2000 的说明，在细胞密度达到70%～80%后转染细胞。使用250 μL 无血清培养基Opti-MEM 分别稀释100 pmol PAX2 shRNA 和100 pmol NC shRNA 序列质粒，在室温下孵育5 min，使用250 μL 无血清培养基Opti-MEM稀释5 μL lipofectamine 2000，在室温下孵育5 min，将稀释后的PAX2 shRNA、NC shRNA 序列质粒分别与稀释后的lipofectamine 2000 充分混合后，室温温育20 min，然后加入预先接种好细胞的培养孔中。细胞在5% CO2、37 ℃下培养8 h 使质粒转入细胞，然后将细胞在完全培养基中培养24～48 h，用于后续的实验。

2.4 细胞分组与处理 选择对数生长期的细胞分为空白组、阴性对照组（用NC shRNA 质粒转染），sh-PAX2 组（用PAX2 shRNA 质粒转染），土槿皮乙酸组（用15 μmol/L 土槿皮乙酸处理未转染的Hela细胞），土槿皮乙酸+sh-PAX2 组（用15 μmol/L土槿皮乙酸处理并用PAX2 shRNA 质粒转染）

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞接种于6 孔板，过夜培养，按照“2.4”项下加入药物处理24 h后，胰酶消化成单细胞悬液，用PBS 洗涤细胞，然后收集1×105～5×105个细胞，每管中加入500 μL 结合缓冲液以悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，充分混合后，室温下避光静置孵育10 min。在1 h 内，将细胞转移至流式细胞仪进行检测。通过软件分析构建包括四个象限的细胞直方图。

2.6 Transwell 小室迁移实验 将4 ℃预冷的以1∶5稀释的基质胶加入到Transwell 上室中，铺匀后在37 ℃下干燥70 min。制备各组细胞悬浮液，每组设置5 个重复孔，将细胞浓度调节至5×105/mL。向上室添加200 μL 细胞悬浮液，向下室添加500 μL 含有20% FBS 的培养基作为趋化因子。按照“2.4”项下加入药物后将小室放入5%CO2、37 ℃下培养24 h，棉签擦去上室中未转移的细胞，PBS 漂洗，甲醇固定细胞，用0.1%结晶紫染色后，每孔选取5 个视野在光学显微镜下拍照，统计各组迁移细胞数目。

2.7 String 预测PAX2 潜在作用蛋白 在https：//string-db.org/网站上对PAX2 的作用蛋白进行预测。

2.8 免疫荧光实验 将生长至对数期的各组细胞以4.5×104个接种至6 孔板中，过夜后按照“2.4”项下加入药物处理细胞24 h，洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞，0.25% Triton×100 透膜，10%山羊血清封闭，加入一抗4 ℃过夜，洗涤，加入二抗，室温2 h，洗涤，倒置荧光显微镜拍照。

2.9 Western blot 实验 待细胞生长至对数期，按照“2.4”项下加入药物处理细胞24 h 后，采用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液。同时取一小部分用BCA 法检测蛋白浓度。通过10%或12%的SDS-PAGE 电泳分离蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。将膜用含有5% 脱脂牛奶的TBST 室温封闭2 h。（PAX2、MMP2、MMP9、Bcl-2、BAX、GAPDH 以1∶1 000稀释，Cyclin D1、Survivin 以1∶1 500稀释，β-catenin 以1∶5 000 稀释，p-β-catenin 以1∶800 稀释）4 ℃下孵育一抗过夜，TBST 洗涤后室温孵育二抗2 h，洗涤，加入ECL 发光液显色并在自动曝光仪中拍照。采用ImageProPlus 软件分析各蛋白条带的灰度值，计算相对表达量。

2.10 统计学分析 采用SPSS 25.0 进行统计分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson 相关分析，以P≤0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 土槿皮乙酸对CC 细胞增殖的影响 在同一时间下土槿皮乙酸对各细胞增殖的抑制率均随浓度的增加而增加，在同一浓度下土槿皮乙酸对各细胞增殖的抑制率均随时间的增加而增加，提示土槿皮乙酸可时间-浓度依赖地抑制CC 细胞增殖（图1）。此外在同一处理时间下，土槿皮乙酸对各细胞的IC50不同，其中在24、48、72 h 下的IC50由大到小依次均为MS751、C33A、CaSki、SiHa 和 Hela（表1）。由于Hela 细胞对土槿皮乙酸最敏感，故本研究选取Hela 细胞作为后续研究对象，土槿皮乙酸处理Hela 细胞24 h，IC50约为15 μmol/L，因此后续土槿皮乙酸处理浓度选为15 μmol/L。

3.2 各CC 细胞中PAX2 蛋白表达及其与土槿皮乙酸对各细胞的IC50的相关性分析 在各CC 细胞中，PAX2 蛋白表达由高到低依次为Hela、SiHa、CaSki、C33A 和MS751。经相关性分析发现，在各CC 细胞中PAX2 表达与土槿皮乙酸对各细胞24、48、72 h 的IC50均呈负相关，其中48、72 h 的IC50与PAX2 表达呈显著性负相关（P＜0.05）（图2）。

3.3 shRNA 转染Hela 细胞后各组细胞中PAX2 蛋白表达 土槿皮乙酸可抑制Hela 细胞中PAX2 蛋白表达，与空白组相比，阴性对照组细胞中PAX2 蛋白表达无差异（P＞0.05）；与阴性对照组相比，sh-PAX2 组、土槿皮乙酸组和土槿皮乙酸+sh-PAX2组细胞中PAX2 蛋白表达均降低（P＜0.05）（图3）。

图1 土槿皮乙酸对CC 细胞增殖的影响（n=3）Fig.1 Effects of PAB on CC cells proliferation（n=3）

表1 土槿皮乙酸对各CC 细胞的IC50（μmol/L，，n=3）Tab.1 IC50 of PAB on all CC cells（μmol/L，，n=3）

表1 土槿皮乙酸对各CC 细胞的IC50（μmol/L，，n=3）Tab.1 IC50 of PAB on all CC cells（μmol/L，，n=3）

3.4 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞凋亡的影响 与空白组比较，阴性对照组细胞的早晚期凋亡率无变化（P＞0.05），sh-PAX2 组、土槿皮乙酸组和土槿皮乙酸+sh-PAX2 组细胞的早晚期凋亡率较阴性对照组均升高（P＜0.05）（图4）。

3.5 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞迁移的影响 与空白组比较，阴性对照组细胞的迁移数无变化（P＞0.05），sh-PAX2 组、土槿皮乙酸组和土槿皮乙酸+sh-PAX2 组细胞的迁移数较阴性对照组比较，均降低（P＜0.05）（图5）。

图2 各CC 细胞中PAX2 蛋白表达及其与土槿皮乙酸对各细胞的IC50的相关性分析Fig.2 PAX2 protein expression in all CC cells and its correlation with IC50 of PAB on all CC cells

3.6 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞凋亡及转移相关蛋白表达的影响 与空白组比较，阴性对照组细胞中Bcl-2、BAX、Cyclin D1、Survivin、MMP2 和MMP9 蛋白表达无变化（P＞0.05）；与阴性对照组相比，sh-PAX2 组、土槿皮乙酸组和土槿皮乙酸+sh-PAX2 组细胞中Bcl-2、Cyclin D1、Survivin、MMP2 和MMP9 蛋白表达均显著降低，BAX蛋白表达均升高（P＜0.05）（图6）。

图3 各组细胞中PAX2 蛋白表达Fig.3 PAX2 protein expression in cells of each group

图4 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of PAB and weak PAX2 expression on Hela cells apoptosis

图5 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞迁移的影响Fig.5 Effects of PAB and weak PAX2 expression on Hela cells migration

图6 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞凋亡及转移相关蛋白表达的影响Fig.6 Effects of PAB and weak PAX2 expression on the expression of proteins relevant to the apoptosis and metastasis of Hela cells

3.7 String 预测PAX2 潜在作用蛋白 借助蛋白质网络的相互作用分析，发现癌症信号传导过程中PAX2 与Wnt 信号关系密切（图7）。

图7 String 预测PAX2 潜在作用蛋白Fig.7 Potential protein of PAX2 predicted by String

3.8 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞β-catenin、p-β-catenin 蛋白的影响 与空白组相比，阴性对照组细胞中β-catenin、p-β-catenin 蛋白表达无变化（P＞0.05），可见大量β-catenin 蛋白定位于细胞核；与阴性对照组相比，sh-PAX2 组、土槿皮乙酸组和土槿皮乙酸+sh-PAX2 组细胞中β-catenin、p-β-catenin 蛋白表达均降低（P＜0.05），可见定位于细胞核的 β-catenin 蛋白明显减少（图8）。

4 讨论

图8 土槿皮乙酸和低表达PAX2 对Hela 细胞β-catenin、p-β-catenin 蛋白的影响Fig.8 Effects of PAB and weak PAX2 expression on β-catenin and p-β-catenin proteins in Hela cells

土槿皮乙酸越来越多的被认为是一种潜在的抗癌活性物质，具有促进不同类型肿瘤细胞凋亡的作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胰腺癌和CC 等［11-12］。本研究发现土槿皮乙酸可时间-浓度依赖地抑制多种CC 细胞增殖，其中土槿皮乙酸对Hela 细胞24、48、72 h 的IC50均最小，提示Hela 细胞对土槿皮乙酸的干预最为敏感。前期研究发现土槿皮乙酸通过抑制PAX2 表达来诱导Hela 细胞凋亡并抑制其转移，但是相关分子机制的文献报道较少，有研究者在其他肿瘤细胞中对土槿皮乙酸抗肿瘤作用的分子机制做了大量的研究，发现土槿皮乙酸诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其转移所涉及的信号通路和靶分子多种多样，包括PI3K/Akt、ERK1/2 信号或者 Bcl-2、PKC 和caspase 家族的多种分子［4，11］。本研究首先对各CC细胞中PAX2 蛋白表达进行检测，并结合前面测出的土槿皮乙酸对各细胞的IC50，分析两者之间的相关性，发现在各CC 细胞中，PAX2 蛋白表达由高到低依次为Hela、SiHa、CaSki、C33A 和MS751，并且与土槿皮乙酸对各细胞24、48、72 h 的IC50均呈负相关，提示土槿皮乙酸对各细胞增殖抑制能力与PAX2 表达呈正相关，PAX2 表达越高，细胞对土槿皮乙酸的增殖抑制的敏感性越高，土槿皮乙酸可能直接或间接靶向作用于PAX2，从而实现对Hela 细胞增殖和转移的抑制，并诱导其凋亡。

PAX2 在起源于苗勒氏管的输卵管、子宫内膜、宫颈和上部阴道的上皮细胞中表达［13］。PAX2在子宫内膜癌细胞中高表达，下调PAX2 可抑制细胞增殖、迁移和侵袭［14］。由于卵巢癌不同的组织学类型，PAX2 在卵巢癌中可能具有致癌和抑癌功能，这可能取决于卵巢癌细胞的表观遗传学改变［15］。PAX2 在CC 细胞中表达也大幅上调，用CP-31398 或sh-PAX2 处理Hela 和SiHa 细胞，可以抑制细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡［16］。PAX2 越来越多的被认为是生殖器官相关癌症发生的标志基因。本研究发现通过敲低Hela 细胞中PAX2 表达可显著诱导Hela 细胞凋亡，上调促凋亡因子BAX 表达和下调抑凋亡因子Bcl-2、Survivin和Cyclin D1 表达；同时抑制Hela 细胞迁移以及下调MMP2 和MMP9 表达，MMP2 和MMP9 均通过降解细胞外基质促进肿瘤转移；提示降低CC 细胞中PAX2 表达可诱导CC 细胞凋亡，抑制其转移。进一步研究发现土槿皮乙酸可显著抑制CC 细胞中PAX2 表达，同时诱导细胞凋亡并抑制其转移。以上揭示土槿皮乙酸导致的PAX2 下调在土槿皮乙酸诱导的CC 细胞凋亡和抑制其转移过程中扮演重要角色，但是其中的具体机制仍需进一步研究。

借助蛋白质网络的相互作用分析，发现癌症信号传导过程中PAX2 与Wnt 信号关系密切。经典的Wnt/β-catenin 信号通路被发现与CC 细胞的增殖、转移等相关［17］。在该通路中β-catenin 的异常磷酸化使其在细胞内积累并进入细胞核与TCF/LEF 形成转录复合物，调节多种下游周期和增殖相关因子的表达，包括cMYC、Cyclin D1、Survivin、Axin2和MMPs［18］。本研究发现土槿皮乙酸和低表达PAX2 均可降低Hela 细胞中β-catenin 和p-β-catenin蛋白表达，另外通过免疫荧光实验对Hela 细胞中β-catenin 进行定位，发现土槿皮乙酸和低表达PAX2 组Hela 细胞核中β-catenin 表达显著降低；结合前面土槿皮乙酸对CC 细胞PAX2 表达的抑制作用，提示土槿皮乙酸可通过影响PAX2 与Wnt/β-catenin 信号通路的相互作用，诱导CC 细胞凋亡并抑制其转移。

综上所述，在CC 细胞中，土槿皮乙酸通过抑制PAX2 表达和Wnt/β-catenin 信号通路来诱导细胞凋亡，抑制其转移。提示土槿皮乙酸是诱导宫颈癌Hela 细胞凋亡的潜在治疗药物。