金正勋，王 珊，王思宇，王 剑，张忠臣，李钢夑，朴钟泽

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.韩国农村振兴厅农业科学院，全罗北道全州 54874；3.上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海 201403）

水稻产量和品质形成主要是淀粉和蛋白质合成与积累过程，水稻籽粒中淀粉占糙米质量90%，蛋白质占8%～10%。蛋白质含量、直链淀粉含量及支链淀粉链长精细结构影响水稻产量和品质[1]。淀粉生物合成过程中由多个关键酶基因担负特殊功能，如GBSS1、AGPL2、SSSⅠ、SBEⅡb和ISA1，每个基因转录表达量直接影响其对应酶活性，造成淀粉含量和精细结构变化，影响淀粉品质；RSR1 转录因子调控淀粉合成相关酶基因转录表达，RSR1表达水平与淀粉合成关键酶基因转录表达水平关系密切[2]。谷氨酰胺合成酶（GS）是无机氮转化为有机氮第一步，对植物组织蛋白质含量影响较大[3]。转录表达是基因表达调控重要环节之一，转录表达量与酶活性和基因性状表现线性关系密切。稻米淀粉和蛋白质合成与积累通常是基因型、环境及其互作结果，碳氮代谢相关基因转录表达量易受温度、水分胁迫及土壤养分等外源环境影响[4-5]。

钾是植物生长发育必需大量营养元素之一，在水稻中广泛参与植株体光合作用、细胞渗透调节、酶活化、蛋白质合成、籽粒品质及产量形成等过程，称为品质元素。关于钾素对水稻籽粒碳氮代谢的影响，普遍认为其直接提高籽粒蛋白质含量，影响籽粒淀粉组分及含量，适量钾素可降低直链淀粉含量及直链与支链淀粉比。目前钾素对稻米品质研究集中在生理生化对碳氮代谢产物含量的影响，尤其是水稻产量因素构成及品质分析占主体[6]，而钾素对水稻籽粒品质形成过程中碳氮代谢相关酶基因家族转录表达量影响研究较少。因此，本试验选用两个不同穗型水稻品种，研究钾素施用量对水稻籽粒灌浆过程中氮素同化关键酶基因GS1:3 及调控淀粉精细比例相关的GBSS1、AGPL2、SSSⅠ、SBEⅡb、ISA1 和转录因子RSR1基因转录表达量的影响，旨在阐明钾素营养对水稻碳氮代谢分子调控机理，为建立优质高产栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验处理

选用穗重型超级稻品种松粳9号及穗数型国标一级优质米品种龙稻18号，于2018年和2019年在东北农业大学农学院盆栽场开展盆栽试验，盆规格长×宽×高为60 cm×40 cm×40 cm。大钵体盘育苗，4 月7 日播种，每个孔播2 粒催芽籽，大棚旱育秧管理，5 月18 日选长势一致且健壮秧苗插秧，行距30 cm，穴距10 cm，每盆插2行8穴，每穴插2 颗苗，每个品种各处理插3 盆，3 次重复，正常水管理。

全生育期总施氮量为纯氮105 kg·hm-2，N:P为1:0.5，以盆表面积折算成每盆施肥量。在此施氮肥基础上根据寒地水稻栽培施钾水平设4个施钾肥处理，以T1不施钾肥为对照，T2、T3和T4的N:K分别为1:0.5、1:1 和1:1.5，施用肥料为分析纯尿素、磷酸二铵和硫酸钾。施肥方法为全部磷肥、50%总氮肥量和50%总钾肥量作为基肥，20%总氮肥量作为分蘖肥，30%总氮肥量和50%总钾肥量作为穗肥。分蘖肥在第5片叶完全展开后施入，穗肥倒2叶展开约50%时施入。

1.2 取样方法

植株取样方法：施入穗肥后分别于第0、15、30 天取样，每次各处理选取两穴代表性植株地上部分，105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒重，用粉样机粉碎，过60 目筛，制成干粉样品，用于测定植株全钾含量。

籽粒取样方法：供试松粳9 号和龙稻18 号集中抽穗日期分别为7 月27 日和7 月20 日，各处理选取长势一致且同日穗部抽出叶鞘3 cm 穗挂牌标记，分别在抽穗后10、20 和30 d 取挂牌标记穗，每个重复每次取3个穗，迅速用液氮处理后选取穗中部灌浆程度基本一致籽粒30 粒，低温去颖壳后将其混合放入密封冻存管中，置于-80 ℃冰柜中保存用于后续试验。

1.3 植株全钾含量测定

采用火焰光度计法测定植株全钾含量[7]，每个样品重复3次。

1.4 基因转录表达量测定方法

取-80 ℃冰柜中保存籽粒，采用Trizol 法提取总RNA，用脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ消除基因组DNA 污染后，采用反转录试剂盒（NOVA，购自江苏愚公生命科技有限公司）合成cDNA。使用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）已公布基因DNA 序列，Premier 5.0 软件设计qRT-PCR 引物（见表1）。以cDNA 为模板，Actin1为内参基因，参照TaqSYBR®Green qPCR 试剂盒作qRT-PCR，每个样品重复3次。采用实时荧光定量法测定基因转录表达量，参照Delte- DelteCt 法分析基因相对转录表达量[8]，①ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；②ΔΔCt=ΔCt（试验组）-ΔCt（对照组）；③基因表达量=2-ΔΔCt。

表1 qRT-PCR反应引物设计Table 1 Desgin of qRT-PCR reaction primer

1.5 数据处理与分析

2018 年与2019 年试验结果趋势一致，本文选用2019 年试验数据作分析，数据处理采用Excel 2007和SPSS 23.0软件，LSD法作显著性测验。

基因下调率（%）=（对照基因表达量-处理基因表达量）/对照基因表达量×100%；

基因上调率（%）=（处理基因表达量-对照基因表达量）/对照基因表达量×100%；

基因衰减率（%）=（抽穗后20 d 基因表达量-抽穗后30 d 基因表达量）/抽穗后20 d 基因表达量×100%；

基因上升率（%）=（抽穗后30 d 基因表达量-抽穗后20 d 基因表达量）/抽穗后20 d 基因表达量×100%。

2 结果与分析

2.1 不同钾肥处理对植株全钾含量的影响

由表2可见，供试两个不同穗型品种施钾肥处理各时期植株全钾含量均极显著高于未施钾肥处理（T1），且随施钾肥量增加植株全钾含量也逐渐升高，其升高幅度超级稻品种松粳9 号为14.30%～25.79%，优质品种龙稻18号为8.07%～20.98%，升高幅度因品种穗型不同而异，说明增加土壤钾素含量极显著提高不同穗型水稻品种生长发育过程中植株全钾含量。随生长进程植株钾素含量逐渐下降，下降幅度高达48.73%～52.37%，但两个不同穗型品种增施钾肥各处理植株全钾含量仍极显著高于未施钾肥处理（T1），说明增施钾肥可维持植株较高钾含量。

2.2 钾素对灌浆不同时期籽粒GBSSⅠ基因转录表达量的影响

3 个不同灌浆时期籽粒GBSSⅠ基因转录表达量方差分析结果表明，两个不同穗型品种在不同钾素施入量下均存在极显著差异，说明不同灌浆时期籽粒GBSSⅠ基因转录表达量对钾素调控响应有极显著差异，受钾素调控影响基因转录表达量发生极显著变异。

多重比较可知（见表3），供试两个不同穗型品种灌浆不同时期籽粒GBSSⅠ基因转录表达量对各处理响应值较不施钾素对照T1降低，表明GBSSⅠ基因转录表达量对钾素调控有明显响应。两个不同穗型水稻品种灌浆期间GBSSⅠ基因转录表达量对钾素调控响应一致，均为T1>T2>T3>T4。从基因转录表达量下调率比较可知，随钾素施入量提高其下调率逐渐升高，T4 处理下调率最高。两个不同穗型水稻品种平均下调率分别为10.02%和9.78%。说明钾素对籽粒GBSSⅠ基因转录表达量具有调控作用，基因转录表达量响应值因品种穗型及灌浆时期不同，差异较大。

由表3可见，在灌浆过程中供试两个不同穗型水稻品种在钾素调控下籽粒GBSSⅠ基因转录表达量呈单峰曲线变化，抽穗后20 d 基因转录表达量达峰值，后开始下降，但钾素施入量不同下降速率和程度差异较大。从基因转录表达量衰减率比较可知，随钾素施入量增加，两个不同穗型水稻品种衰减率变化不显著，说明钾素施入量提高对各时期基因转录表达量有显著抑制作用，但对衰减率无显著影响。

表2 钾素施入量对植株全钾含量的影响Table 2 Effect of potassium application rate on the total potassium content of plants

表3 水稻灌浆不同时期GBSSⅠ基因转录表达量对钾素的响应Table 3 Response of the transcriptional expression of GBSSⅠgene to potassium in different stages of rice grain filling

2.3 钾素对灌浆不同时期籽粒AGPL2 和SSSⅠ及SBEПb和ISA1基因转录表达量的影响

3 个不同灌浆时期籽粒AGPL2 和SSSⅠ基因转录表达量方差分析结果表明，两个不同穗型品种在不同钾素施入量下均存在极显著差异，说明灌浆不同时期籽粒AGPL2和SSSⅠ基因转录表达量对钾素调控响应有极显著差异，受钾素调控影响基因转录表达量发生极显著变异。进一步多重比较可知（见表4），供试两个不同穗型品种灌浆不同时期籽粒AGPL2和SSSⅠ基因转录表达量对各处理响应值均较不施钾素对照T1升高，T4处理最高，表明AGPL2和SSSⅠ基因转录表达量对钾素调控有明显响应。两个不同穗型水稻品种灌浆期间AGPL2和SSSⅠ基因转录表达量对钾素调控响应接近，均为T4>T3>T2>T1。从基因转录表达量上调率比较可知，随钾素施入量增加其上调率逐渐升高，两个不同穗型水稻品种AGPL2 平均上调率分别为20.89%和16.80%，SSS Ⅰ平均上调率分别为20.58%和21.95%，说明钾素对籽粒AGPL2 和SSSⅠ基因转录表达量均具有调控作用，且基因转录表达量响应值因品种穗型及灌浆时期不同而差异较大。

表4 水稻灌浆不同时期AGPL2及SSSⅠ基因转录表达量对钾素的响应Table 4 Response of AGPL2 and SSSⅠgene transcription expression levels to potassium in different stages of rice grain filling

由表4可知，在灌浆过程中供试两个不同穗型水稻品种在钾素调控下籽粒AGPL2和SSSⅠ基因转录表达量呈单峰曲线变化，抽穗后20 d 基因转录表达量达峰值，后开始下降，但不同钾素施入量下下降速率和程度差异较大。由基因转录表达量衰减率比较可知，随钾素浓度增加，两个不同穗型水稻品种AGPL2 衰减率先升后降，衰减率依次为T3>T4>T2>T1，两个不同穗型水稻品种平均衰减率分别29.73%和39.81%；SSSⅠ衰减率逐渐降低，衰减率依次为T4>T3>T2>T1，两个不同穗型水稻品种平均衰减率分别为34.36%和35.19%。说明适当提高钾素施入量可使籽粒AGPL2和SSSⅠ基因转录表达上调，衰减率则不同。

3个不同灌浆时期籽粒SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量方差分析结果表明，两个不同穗型品种在不同钾素施入量下均存在极显著差异，说明灌浆不同时期籽粒SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量对钾素调控响应有极显著差异，受钾素调控影响基因转录表达量发生极显著变异。多重比较可知（见表5），供试两个不同穗型品种灌浆不同时期籽粒SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量对各处理响应值均较不施钾素对照T1升高，表明SBEⅡb和ISA1基因转录表达量对钾素调控有明显响应。两个不同穗型水稻品种灌浆期间SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量对钾素调控响应接近，均为T4>T3>T2>T1。从基因转录表达量上调率比较可知，随钾素施入量增加其上调率逐渐升高，两个不同穗型水稻品种SBEⅡb平均上调率分别为15.87%和16.82%，ISA1平均上调率分别为9.95%和4.17%，说明钾素对籽粒SBEⅡb和ISA1 基因转录表达量均具有调控作用，基因转录表达量响应值因品种穗型及灌浆时期不同而差异较大。

表5 水稻灌浆不同时期SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量对钾素的响应Table 5 Response of the transcriptional expression of SBEⅡb and ISAⅠgenes to potassium in different stages of rice grain filling

由表5可知，在灌浆过程中供试两个不同穗型水稻品种在钾素调控下籽粒SBEⅡb和ISAⅠ基因转录表达量呈单峰曲线变化，抽穗后20 d 基因转录表达量达峰值，后开始下降，但不同钾素施入量下其下降速率和程度差异较大。由基因转录表达量衰减率比较可知，随钾素施入量增加，两个不同穗型水稻品种SBEⅡb衰减率逐渐升高，衰减率依次为T4>T3>T2>T1。说明灌浆中后期籽粒SBEⅡb基因转录表达量下降速率和幅度与钾素关系密切，因水稻品种不同衰减率不同。ISA1 衰减率受钾素影响弱。

2.4 钾素对灌浆不同时期籽粒RSR1基因转录表达量的影响

3 个不同灌浆时期籽粒RSR1 基因转录表达量方差分析结果表明，两个不同穗型品种在不同钾素施入量下均存在极显著差异，说明灌浆不同时期籽粒RSR1基因转录表达量对钾素调控响应有极显著差异，受钾素调控影响基因转录表达量发生极显著变异。进一步多重比较可知（见表6），供试两个不同穗型品种灌浆时期随土壤钾素浓度升高籽粒RSR1 基因转录表达量逐渐降低，T4 处理最低，表明RSR1基因转录表达量对钾素调控有明显响应。两个不同穗型水稻品种灌浆期间RSR1 基因转录表达量对钾素调控响应接近，均为T1>T2>T3>T4。从基因转录表达量下调率比较可知，随钾素施入量增加其下调率逐渐升高，两个不同穗型水稻品种平均下调率分别为21.15%和16.11%。说明钾素对籽粒RSR1基因转录表达量具有显著下调作用，且基因转录表达量响应值因品种穗型及灌浆时期不同而差异较大。在灌浆过程中供试两个不同穗型水稻品种在钾素调控下籽粒RSR1 基因转录表达量为先降后升的“V”字型单峰曲线，抽穗后20 d基因转录表达量均达最低，后开始升高，但不同钾素施入量下其升降速率和程度差异较大。从基因转录表达量上升率比较可知，随钾素施入量增加，两个不同穗型水稻品种上升率逐渐升高，上升率依次为T4>T3>T2>T1，两个不同穗型水稻品种上升率平均值分别为17.53%和5.69%，说明适当提高钾素施入量可增加籽粒RSR1基因转录表达量上升率。灌浆中期籽粒RSR1基因转录表达量下降速率和幅度与钾素关系密切，且灌浆后期因水稻品种不同钾素条件下上升率也不同。

表6 水稻灌浆不同时期RSR1基因转录表达量对钾素的响应Table 6 Responses of the transcriptional expression of RSR1 gene to potassium in different stages of rice grain filling

2.5 钾素对灌浆不同时期籽粒GS1:3 基因转录表达量的影响

3 个不同灌浆时期籽粒GS1:3 基因转录表达量方差分析结果表明，两个不同穗型品种在不同钾素施入量下均存在极显著差异，说明灌浆不同时期籽粒GS1:3基因转录表达量对钾素调控响应有极显著差异，受钾素调控影响基因转录表达量发生极显著变异。

由多重比较可知（见表7），供试两个不同穗型品种灌浆不同时期籽粒GS1:3基因转录表达量对各处理响应值均较不施钾素对照T1升高，并在T3处理下达峰值，表明GS1:3基因转录表达量对钾素调控有明显响应。两个不同穗型水稻品种灌浆期间GS1:3基因转录表达量对钾素调控响应接近，均为T3>T4>T2>T1。从基因转录表达量上调率比较可知，随钾素施入量增加其上调率逐渐升高，两个不同穗型水稻品种平均上调率分别为17.54%和17.43%。说明钾素对籽粒GS1:3基因转录表达量具有调控作用，基因转录表达量响应值因品种穗型及灌浆时期不同而差异较大。

表7 水稻灌浆不同时期GS1:3基因转录表达量品种间比较及对钾素的响应Table7 Comparison of GS1:3 gene transcript expression levels at different stages of rice grain filling and response to potassium

在灌浆过程中供试两个不同穗型水稻品种在钾素调控下籽粒GS1:3基因转录表达量呈单峰曲线变化，抽穗后20 d 基因转录表达量达峰值，开始下降，但不同钾素浓度调控下降速率和程度差异较大。由基因转录表达量衰减率比较可知，随钾素施入量增加，两个不同穗型水稻品种衰减率先升后降，衰减率依次为T3>T4>T2>T1，两个不同穗型水稻品种平均衰减率分别为62.69%和58.24%，说明适当提高钾素施入量可增加籽粒GS1:3基因转录表达量衰减率，当土壤钾素浓度过高时则无法继续提升其衰减率。说明灌浆中后期籽粒GS1:3基因转录表达量下降速率和幅度与钾素关系密切，因水稻品种不同钾素衰减率也不同。

3 讨论与结论

基因转录为基因表达调控重要环节之一，其表达量不仅受遗传因素控制，受氮磷钾营养、温度、水分等外源环境因素影响。RSR1 基因编码的蛋白是在水稻众多转录因子中的一个，对淀粉合成至关重要，RSR1 不仅负调控淀粉合成酶基因AGPL2、SSSⅠ和ISA1 转录表达量，且受低温、干旱、ABA、ACC抑制，受NaCl诱导表达[9]。研究表明，适当增加氮肥浓度处理对水稻GBSS1、ISAs、AGPL2 和GS基因转录表达量起正向调控作用[10-11]。钾素有利于高等植物光合作用关键酶Rubisco 同工型基因转录表达[12]，利于光合产物积累；可参与马铃薯钾转运体KUP6 和KUP7 基因表达量调节[13]。王金明研究结果表明，AGPase 小亚基基因GBSSⅠ、SSSⅢ和SBE可能主要通过转录水平控制块茎淀粉合成[14]。在钾素对转录因子调控研究中，赵帅通过酵母双杂交法阐述拟南芥转录因子ARF2对钾素响应机制[15]。

本试验研究可知，随钾素施入量增加不仅不同穗型品种植株全钾含量逐渐极显著升高，且籽粒AGPL2、SSSⅠ、SBEⅡb和ISAⅠ及GS1:3转录表达量也逐渐上调，但籽粒GBSSⅠ和RSR1基因转录表达量反而逐渐下调，基因转录表达量均显著上调和下调，其中钾素施入量超过某一临界值时籽粒GS1:3基因转录表达量反而降低，表现高浓度钾素抑制该基因表达。说明灌浆过程中籽粒碳氮代谢相关酶基因转录表达量受外源钾素调控。从基因转录表达量衰减率比较可知，各基因衰减率存在显著差异，AGPL2 衰减率先升后降，在T3 处理下最大，SSSⅠ衰减率保持不变，SBEⅡb衰减率逐渐降低，ISA1 衰减率变化不明显，不同基因转录表达量对不同钾素施入量响应程度不同，但维持基因高转录表达量需施入一定量钾素。鉴于基因转录表达量与酶活性强弱线性关系密切，基因转录表达量高，酶活性强，反之酶活性低。酶活性直接影响性状表现程度，酶活性高性状表现强，反之表现弱。可知，基因转录表达量调控是外源钾素营养等对生物性状调控作用的分子基础，如何调控基因转录表达量有待深入研究。

环境因素对稻米蒸煮食味品质的影响国内外从生理生化及分子水平上已开展大量研究，但基因转录表达调控层面上的研究报道较少。在水稻籽粒灌浆过程中不断发生淀粉合成相关的碳代谢和蛋白质合成相关的氮代谢，稻米淀粉及蛋白质含量既受遗传主效应控制，又受基因型与环境互作效应影响。朱方旭等在氮素对水稻碳氮代谢相关研究中发现，氮素营养可影响蛋白质合成相关氮代谢和淀粉合成相关碳代谢，改变蛋白质含量及淀粉组分含量，灌浆成熟期氮素可通过提高GS1:3 基因转录表达量从而提高蛋白质含量[16]。灌浆过程中增加氮素营养可改变GBSS1、ISA1和AG⁃PL2 基因转录表达量，提高GBSS、ISA 和Su Sy 等淀粉合成关键酶活性，而基因转录表达量与酶活性、淀粉合成量呈线性关系，而RSR1 则负调控淀粉合成酶基因AGPL2、SSSⅠ和ISA1转录表达量。

钾素可调控作物生长发育过程中多种相关基因表达量。提高钾素施入量可提高其千粒重[17]，这是因为籽粒主要成分为淀粉和蛋白质，钾素可促进淀粉和蛋白质合成[18-19]，淀粉和蛋白质又是影响稻米蒸煮食味品质重要因素。GBSSⅠ、AGPL2、SSSⅠ、SBEⅡb、ISA1和GS1:3基因在水稻籽粒中特异性表达，是参与籽粒淀粉和蛋白质合成关键酶基因。水稻GBSSⅠ表达受阻，致使胚乳中几乎不含直链淀粉[20]，GBSSⅠ基因mRNA 表达量与直链淀粉含量同步变化；SBE酶催化支链淀粉精细结构，高温致使水稻胚乳中SBE 酶活性显著下降，稻米支链淀粉长B链比例也降低[21]。邹铁祥等指出，施用钾素可明显提高小麦和玉米灌浆期间籽粒ADPGPPase、SBE、GBSS 和SSS 活性，使淀粉积累量增加[22]；张玲等表示，适当钾素可通过提高GBSS 和SSS两种酶活性，影响直链淀粉含量，影响稻米品质[23]。

本试验结果表明，淀粉及蛋白质合成相关酶基因转录表达受外源钾素营养调控影响较大，而基因转录为基因表达调控重要环节，表达量直接影响酶活性强弱，影响表观性状或碳氮化合物合成积累。钾素促进籽粒GS1:3基因转录表达量，提高籽粒蛋白质含量，淀粉精细结构，钾素促进淀粉生物合成第一个关键限速酶基因AGPL2 转录表达，提高其总淀粉含量；抑制直链淀粉含量主效基因GBSSⅠ转录表达，促进编码合成支链淀粉较短支链的SSSⅠ、决定支链淀粉结构的SBEⅡb和移除不当分支的ISAⅠ基因转录表达量，影响稻米蒸煮食味品质。本试验选择碳氮代谢相关酶基因是众多酶基因中一部分，但却是参与淀粉和蛋白质合成代谢的关键酶基因，酶活性变化影响淀粉和蛋白质含量及分子结构，影响稻米蒸煮食味品质。因此，外源钾素营养对稻米蒸煮食味品质的影响通过籽粒碳氮代谢相关酶基因转录表达量调控实现。淀粉精细结构影响稻米蒸煮食味品质，深入研究外源钾素与各基因表达调控及淀粉精细结构间关系，对提高稻米蒸煮食味品质及建立环保型高效优质水稻栽培技术具有重要实践意义。