荆雅玮,左佳坤,,王志豪,胡剑刚,黄燕,米荣升,苗晋锋,PHOUTHAPANE Vanhnaseng,陈兆国,韩先干*

(1.中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;2.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095;3.老挝科技部生态与生物技术研究所,万象 22797)

布氏杆菌病是一种重要的人畜共患传染病,由布氏杆菌(Brucella)入侵机体引起,世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)将该病列为必须通报的疫病,我国将其列为二类动物疫病。人感染该病后主要表现为发热、关节痛、全身乏力和多汗等症状,动物感染该病后主要表现为母畜流产、子宫炎、关节炎和睾丸炎等症状。全世界每年布氏杆菌发病人数超过50万例,170多个国家有该病发生[1]。该病不但对养殖业造成重大经济损失,同时也严重威胁食品安全和公共卫生,开展布氏杆菌致病机制研究,可为该病的有效防控提供理论支撑。

由sahH基因编码的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)广泛存在于细胞中,并在新陈代谢过程中起重要作用[2-3]。对SahH在人及其他真核细胞中的研究表明,SahH可引起包括肿瘤、神经系统、心血管系统及肌肉病变等在内的多种疾病[4-6]。而SahH在细菌中的研究较少,SahH参与细菌的甲硫氨酸循环,甲硫氨酸通过ATP活化和去甲基化后形成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH),SAH在SahH的催化作用下生成同型半胱氨酸(homocysteine,HCY),HCY再重新生成甲硫氨酸的过程,称为甲硫氨酸循环[7-8]。甲硫氨酸循环在细菌的DNA合成、蛋白质翻译和甲基化等过程中发挥重要作用。

对埃氏慢生根瘤菌SahH的晶体结构研究表明,SahH由4个亚基组成,每个亚基由底物结合位点、辅因子结合位点和羧基端二聚体组成,并由于辅因子的结合,通过形成开放和闭合两种构象,影响其催化活性[9]。在影响SahH催化活性的众多因素中,NAD+作为辅因子,参与调控包括结核杆菌、海洋热菌等在内的多种细菌的SahH催化活性[10]。研究表明,维持细胞的SAH/SAM平衡,对其发挥生理功能具有重要的调节作用,而SahH的活性是维持SAH/SAM平衡的关键。因此,通过调控布氏杆菌SahH的催化活性,实现对其胞内SAM/SAH平衡的调控,可为布氏杆菌病的防控提供新思路。

目前关于布氏杆菌SahH的研究较少,仅有对其免疫原性和催化活性研究,尚未见影响其催化活性的研究,因此本试验在本课题组前期研究基础上,进一步研究影响其催化活性的因素并鉴定可能的催化活性位点,为后续开展SahH对布氏杆菌的调控作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒以及试剂

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞、质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;表达布氏杆菌SahH(Bru-SahH)的表达载体pET28a-Bru-sahH由本课题组前期构建[11]。限制性内切酶、DNA Marker以及高保真酶购自大连TaKaRa公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 NAD+对SahH催化活性的影响

将表达质粒pET28a-Bru-sahH转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1 mmol·L-1IPTG诱导表达重组蛋白Bru-SahH,纯化后备用[11-12]。

重组蛋白Bru-SahH体外催化活性分析方法参照文献[11-12],采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化的各梯度蛋白进行浓度测定,并取纯化后终浓度为1 mg·mL-1Bru-SahH重组蛋白200 μL与终浓度为 1 mmol·L-1底物SAH作用,同时添加终浓度为100 μmol·L-1外源性NAD+,37 ℃孵育1 h。反应结束后反应液用蛋白超滤管进行离心、超滤,去除反应液中的蛋白后,收集滤液,检测催化产物HCY的生成量,同时以PBS缓冲液作为阴性对照。重复3次。

催化产物HCY的浓度检测方法参照文献[13],DTNB[5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]是一种Ellman’s试剂,可以通过与HCY中的巯基反应,转化成为黄色的 5-巯基-2-硝基苯甲酸,测定412 nm处吸收峰值可确定底物反应液中的HCY含量。将200 μL重组蛋白滤液与100 μL 5 mmol·L-1Ellman’s试剂充分混匀,37 ℃培养箱静置避光孵育30 min,检测反应液的吸光值(A412),根据HCY标准曲线测定重组蛋白SahH的催化活性(HCY的产量)。

1.3 SahH理化特性分析、磷酸化及活性位点鉴定

通过蛋白质理化特性预测网站(https://web.expasy.org/protparam/)分析SahH的理化特性。为了进行SahH的磷酸化位点检测,将重组表达的Bru-SahH经SDS-PAGE凝胶电泳后,切胶送至上海厚基生物科技有限公司进行磷酸化质谱分析。

分别选取流产布氏杆菌(Brucellaabortus,EEP62727.1)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,NC_000962.3)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,JQ894861.1)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei,CAH37303.1)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum,BAL09033.1)、黄杆菌(Flavobacteriabacterium,EAZ95386.1)和哈维弧菌(VibrioharveyiCAIM,EMR35983.1)的SahH氨基酸序列,运用DNAStar等软件,对SahH可能的活性位点进行预测。

1.4 sahH突变表达质粒的构建、表达

通过点突变引物(表1),利用重叠引物延伸PCR(overlap PCR)对表达载体pET28a-sahH的第337位(His)、338位(Phe)和第444位(Ser)氨基酸分别进行单点突变,对337和338位氨基酸进行双突变,构建sahH点突变质粒(表2)。将突变后的重组表达质粒转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达突变的SahH,纯化后备用。

表1 本研究所用引物

表2 SahH定点突变

1.5 SahH突变株的体外催化活性分析

纯化表达的4种SahH突变重组蛋白,采用BCA法测定其浓度。将终质量浓度为4 mg·mL-1的4种SahH突变重组蛋白分别与终浓度为1 mmol·L-1SAH混匀,置于37 ℃培养箱静置孵育1 h,以未突变的SahH作为催化反应的阳性对照,以PBS缓冲液作为阴性对照,评价SahH突变重组蛋白的体外催化活性。

2 结果与分析

2.1 NAD+抑制SahH的体外催化活性

对SahH的催化活性检测结果表明,添加终浓度为100 μmol·L-1的NAD+后,SahH对底物的催化活性降低85.6%,表明NAD+对SahH的催化活性具有抑制作用(表3)。

表3 NAD+对SahH催化活性的影响

2.2 Bru-SahH理化特性与活性位点分析

对Bru-SahH的理化特性分析表明,该蛋白含有466个氨基酸(相对分子质量50.79×103),理论等电点5.30,带负电荷残基数(天冬氨酸+谷氨酸)为61,带正电荷残基数(精氨酸+赖氨酸)为49,不稳定指数(instability index)为32.40,表明该蛋白属于稳定蛋白。脂溶指数(aliphatic index)为88.13,总平均亲水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.148。

质谱分析结果表明,Bru-SahH的第444位丝氨酸为预测的磷酸化修饰位点(图1)。

对流产布氏杆菌、结核分枝杆菌、类鼻疽伯克氏菌、铜绿假单胞菌、黄杆菌、哈维弧菌和大豆根瘤菌的SahH氨基酸活性位点分析表明,布氏杆菌SahH的第337和338位存在组氨酸(H)和苯丙氨酸(F)活性位点(图2)。

2.3 sahH突变表达载体的鉴定

测序结果表明,成功构建布氏杆菌sahH的第337、338、444位单突变和337-338位点双突变的4种表达质粒,分别为pET28a-sahH-M337、pET28a-sahH-M338、pET28a-sahH-M444和pET28a-sahH-M337-338(表2,图3)。

2.4 Bru-SahH重组突变蛋白的表达、纯化

将构建的4种sahH突变表达质粒分别转化BL21(DE3),用T7通用引物对重组菌进行PCR鉴定,结果表明成功获得含sahH突变质粒的BL21重组菌(图4)。

含有不同sahH突变质粒的BL21重组菌,均可表达相对分子质量为55×103的Bru-SahH突变蛋白,与预期结果相符。对突变的Bru-SahH蛋白进行纯化,结果表明当咪唑浓度为100和150 mmol·L-1时,Bru-SahH 蛋白的洗脱效率较高(图5)。

2.5 Bru-SahH重组突变蛋白的体外催化活性分析

对突变的Bru-SahH催化活性检测结果(表4)表明,Bru-SahH的第337位和338位氨基酸突变后,其催化活性降低90.8%以上;Bru-SahH的第444位丝氨酸为磷酸化位点,对该位点突变后,其催化活性降低85.5%。

表4 Bru-SahH重组突变蛋白的催化活性

3 讨论

甲硫氨酸代谢对细菌具有重要的调控作用,参与包括DNA复制与修复[14]、磷脂合成和群体感应等过程。SahH是甲硫氨酸循环过程中的关键酶[15-16],在多种疾病(包括癌症、高胆固醇血症、寄生虫及病毒性传染病)中被作为潜在的药物靶标。如在结核病防治中,SahH被提出可作为一种具有前景的药物靶标[17-19]。在人体细胞中SahH功能障碍可引起包括肿瘤、神经系统、心血管系统及肌肉病变在内的多种疾病。在布氏杆菌中,SahH参与甲硫氨酸循环,但对其催化活性的分子机制尚不清楚。

为了探讨影响布氏杆菌SahH催化活性的因素,本研究开展了NAD+对SahH催化活性的影响,结果表明NAD+对SahH的催化活性具有抑制作用。这可能是由于辅因子NAD+可通过氢键和疏水作用与SahH上特定的氨基酸残基相互作用所致。例如在人的SahH中,由于NAD+与SahH的氨基酸残基Asn191、Val224、Ile244和Thr276形成疏水作用和相互作用,从而影响其催化活性[20]。而与NAD+具有相互作用的氨基酸残基可用于作为抑制剂设计的靶位点,同时NAD+的类似物也可作为SahH的抑制剂。

为了进一步分析影响SahH活性的位点,对埃氏慢生根瘤菌的SahH晶体结构研究表明,SahH由4个亚基组成,每个亚基由底物结合位点(substrate-binding domain)、辅因子结合位点(cofactor-binding domain)和羧基端二聚体(C-terminal dimerization domain)组成,并具有开放和闭合2种构象,而调节这种构象的关键是2个相连的氨基酸-组氨酸和苯丙氨酸(HF)[9]。本试验通过对布氏杆菌和其他细菌的SahH进行序列比对,结果发现布氏杆菌SahH也存在第337位组氨酸和第338位苯丙氨酸,通过对SahH上述2个位点的突变,证明第337位组氨酸和第338位苯丙氨酸参与调控SahH的催化活性。突变337位和/或338位氨基酸后,可能破坏了控制布氏杆菌SahH的开放与闭合构象的分子闸门,无法暴露出底物结合位点与辅因子结合位点,进而使布氏杆菌SahH无法结合底物SAH,而使其催化活性大大降低,具体机制仍有待进一步研究。

磷酸化是影响蛋白质活性的重要方式,为了分析SahH可能的磷酸化位点,本试验通过质谱分析,预测布氏杆菌SahH的第444位丝氨酸是潜在的磷酸化修饰位点,突变后其催化活性显著降低,表明该位点在SahH催化活性中具有重要作用。有研究表明,在结核分枝杆菌中,SahH通过被细菌的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化,实现其对酶活的调控[21]。因此,在本试验中,推测当布氏杆菌SahH的第444位丝氨酸突变为半胱氨酸后,布氏杆菌SahH无法被磷酸激酶磷酸化,进而使酶催化活性显著下降。

本试验采用测定SahH催化产物HCY的浓度评价SahH活性位点和氧化型辅酶NAD+对其催化活性的影响,在后续的研究中,将通过开展对布氏杆菌SahH酶活单位、催化反应速度和米氏常数等参数的研究,进一步研究SahH催化活性及其影响因素,为开展布氏杆菌SahH功能研究和基于SahH开展布氏杆菌防控提供新思路。