庞丽君 刘道洁 林明华

[摘要] 目的 构建血管内皮生长因子（VEGF）原核表达载体并诱导其表达蛋白，为后续进行VEGF相关研究奠定基础。 方法 通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增得到目的片段，将DNA片段克隆至带组氨酸标签的pET-30a（+）载体上;构建的重组质粒经过菌液聚合酶链式反应（PCR）及测序方法鉴定;利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒表达，通过蛋白质印迹法（Western blot）进行鉴定。 结果 以HepG2细胞为模板扩增出大小正确的片段;构建的pET-30a-VEGF重组质粒经菌液PCR及DNA测序证实序列正确;考马斯亮蓝染胶和Western blot结果显示IPTG诱导表达的融合蛋白分子量正确且条带单一。 结论 成功构建pET-30a-VEGF原核表达质粒，后续可进行大量诱导表达用于肝癌的诊疗相关研究。

[关键词] 血管内皮生长因子;肝细胞癌;基因克隆;原核表达

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To construct a prokaryotic expression vector containing vascular endothelial growth factor （VEGF） and induce to express protein， it may lay a foundation for the follow-up study of VEGF. Methods Amplified The target fragment was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and the DNA fragment was cloned into pET-30a（+） vector with histidine tag. The recombinant plasmid was identified by polymerase chain reaction （PCR） and sequencing. The expression of recombinant plasmid was induced by isopropylthio-β-D-galactoside （IPTG） and identified by Western blot. Results The right size of the fragment was amplified from HepG2 cells. The recombinant plasmid pET-30a-VEGF was confirmed by PCR and DNA sequencing. Coomassie brilliant blue staining and Western blot results showed that the molecular weight of the fusion protein induced by IPTG was correct and the band was single. Conclusion The prokaryotic expression plasmid of pET-30a-VEGF is successfully constructed， in addition， it might lay the foundation for development of HCC diagnostic and treatment research.

[Key words] Vascular endothelial growth factor; Hepatocellular carcinoma; Gene cloning; Prokaryotic expression

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国肿瘤发病率排第2位的恶性肿瘤，是全世界第4大癌症死亡原因[1]。在肝癌早期，临床治疗效果尚佳，然而70%～80%的患者被发现时已发展为晚期[2]。尽管开发了有效的抗病毒药物[3-5]，但肝癌的发病率仍然呈现逐渐增加的趋势，对人类健康的影响非常大。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌患者中高表达，能诱导肿瘤，促进肿瘤生长和转移，而在正常肝组织中稳定低表达[6]。VEGF是肿瘤血管生成的重要标志物，直接参与肝癌的生长、转移及扩散[7]。研究表明，VEGF可以更好地预测肝癌的预后、血管的侵犯，并可能指导肝脏的靶向治疗[7-9]。本研究进行了VEGF的克隆、表达载体的构建，并诱导表达VEGF重组蛋白，为后续的相关研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株与主要仪器  HepG2肝癌细胞系和pET-30a（+）载体由北京市肝病研究所实验室提供。T100 PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）;Tanon-1600凝胶成像系统;MaxQ HP481EPS 摇床（Thermo Scientific公司）;EF-C5高压细胞破碎仪（加拿大Avestin公司）;EPS-300电泳仪（美国Bio-Rad公司）;Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.1.2 主要试剂  氨苄青霉素和硫酸卡那霉素（Solarbio，A7490、K8020）;IPTG（GPC Biotech，AC367-5G）;胰蛋白胨和酵母提取物（OXOID，LP0042、LP0021）;考马斯亮蓝R250（北京鼎国，C061）;PCR Taq mix（Takara，RR902A）;DNA marker、蓝色预染蛋白质marker和感受态细胞DH5α和Rosetta（DE3）（Biomed，MD102、PM202、BC102、BC204）;Ni-NTA Agarose、化学发光底物、限制性内切酶NdeI和XhoI（Thermo Fisher Scientific，R901-01、34580、FD0583、FD0694）;硝酸纤维素膜（NC膜）（Life Sciences，PALL 66485）;RNA提取试剂盒（Qiagen，74004）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的扩增  提取HepG2细胞总RNA并进行反转录，得到的cDNA作为扩增的模板。设计引物如下，VEGF-upper：5′-CATATGATGGTTGTTAAA-TTCATGGAC-3′，VEGF-lower：5′-CTCGAGGCACAA-CAAATGCGAATGCCGT-3′，两端加入酶切位点NdeI和XhoI，片段长度为279 bp。PCR扩增条件：94℃预变性5 min;95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;最后72℃延伸5 min。扩增产物经电泳鉴定后胶回收。

1.2.2 原核表达载体的构建  PCR扩增时保留C端的组氨酸（His）标签用于后续纯化和鉴定。将上述扩增片段和pET-30a（+）载体用NdeI和XhoI内切酶分别在37℃水浴锅中酶切后胶回收，两者在连接酶的作用下常温连接过夜。连接产物转入DH5α细胞，37℃孵育过夜。次日挑取单克隆，摇菌过夜后通过菌液PCR鉴定，片段大小正确的克隆提取质粒DNA，并送北京博迈德基因技术有限公司进行测序。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达  将重组质粒pET-30a-VEGF转入Rosetta（DE3）细胞，37℃培养过夜后挑单克隆于含有50 mg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃恒温摇床培养12 h后按1∶50比例扩大培养，继续培养2 h，菌体生长到对数期后先留取5 mL菌液作为对照，剩余菌液加入诱导剂IPTG（0.1、0.5、1 mmol/L）后继续培养4 h。

1.2.4 裂解重组蛋白并用SDS-PAGE电泳鉴定  离心收集诱导后的菌体，用PBS重悬菌体沉淀之后加入终浓度为1 μg/mL的溶酶菌，冰上静置30 min;再加入1% NP40、终浓度1 mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF，冰上静置30 min;利用高压均质机破碎菌体;12 000 g，离心30 min收集上清。向裂解后的液体加入蛋白上样缓冲液，98℃加热10 min后吸取上清液进行SDS-PAGE电泳。用考马斯亮蓝过夜染SDS-PAGE胶，脱色后拍照观察蛋白诱导情况。

1.2.5 蛋白质印迹法鉴定重组质粒  向上述上清液中加入适量Ni-NTA，4 ℃孵育过夜，2000 g离心1 min，Ni-NTA清洗3次，離心弃上清液;向沉淀的Ni-NTA中加入适量洗脱液，竞争洗脱目的蛋白。蛋白样品加入上样缓冲液，98℃加热10 min后进行SDS-PAGE电泳，转膜后对NC膜进行封闭、洗膜、孵育抗体，最后进行曝光。

2 结果

2.1 PCR扩增目的片段

以HepG2细胞为模板进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证，扩增出大小正确的DNA片段。见图1。

2.2 重组质粒pET-30a-VEGF的构建及鉴定

上述PCR产物克隆至pET-30a载体中，重组转化后挑单克隆进行菌液PCR，琼脂糖电泳显示条带大小正确，见图2。将验证的重组质粒送北京博迈德基因技术有限公司测序，序列完全正确，显示该质粒构建成功，见图3（封三）。

2.3 诱导表达VEGF融合蛋白

测序正确的质粒pET-30a-VEGF转化入感受态细胞，用不同浓度IPTG诱导，裂解菌液后经过考马斯亮蓝染SDS-PAGE胶。与未诱导组比较，在11 kD位置有明显的蛋白条带，且3个诱导浓度的蛋白表达量没有明显差别。见图4。

2.4 蛋白质印迹法鉴定重组载体表达情况

由于pET-30a-VEGF质粒有His标签，纯化后的融合蛋白可以用His抗体进行鉴定，可以看到一条明显的蛋白条带，大小和目的蛋白一致，提示所构建的重组载体可以正确表达。见图5。

3 讨论

肝细胞癌是最常见的癌症之一，由感染引起的肝硬化是其主要病因，其他因素如酒精、药物、自身免疫性肝炎和非酒精性脂肪肝也与肝癌的发生有关[10-11]。大部分肝癌患者确诊时已属晚期，失去了最佳手术时期，并且放化疗对肝癌几乎无效[12]。索拉非尼作为治疗晚期肝癌的一线治疗药物，被报道可以延长患者的整体生存期2～3个月[13-14]，它是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，靶向多种信号通路，其中就包括以VEGF为中心的通路[15]。有研究报道索拉非尼和其他VEGF抑制剂能明显影响肝癌血管生成和血管通透性[16-17]。VEGF信号通路调控血管形态对肝细胞构筑和肿瘤生长都很重要，VEGF的浓度决定血管生成的方向和血管的延伸以及增长[18]。除了促进血管生成和血管通透性，VEGF还可以在肿瘤中发挥免疫抑制作用，例如VEGF能抑制树突状细胞的成熟并诱导免疫抑制性炎症细胞的积聚[19-20]。此外，在缺氧的肿瘤环境中，VEGF能通过缺氧诱导因子使依赖性途径上调，通过表达更高水平的促炎细胞因子和免疫抑制介质影响肿瘤微环境中的免疫抑制功能[21]。肿瘤微环境中过量的VEGF产生可能有助于癌细胞以多种直接和间接的方式逃避免疫系统，正如相关基础和临床研究所示，抗VEGF治疗在某些情况下可促进抗肿瘤的免疫反应[22-23]。

在免疫微环境中，阻断VEGF是一把双刃剑，它可以增加或减少免疫抑制。因此，联合使用抗血管生成靶向药物和免疫检查点抑制剂治疗肝癌和其他恶性肿瘤时，对于提高疗效至关重要[24-25]。本实验构建的VEGF表达载体能够诱导表达VEGF融合蛋白，无论是将其作为抗原应用或作为后续制备VEGF单克隆抗体，对于肝癌诊疗的相关研究都奠定了一定的基础。

[参考文献]

[1]  Yang JD，Hainaut P，Gores GJ，et al. A global view of hepatocellular carcinoma：trends，risk，prevention and management [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2019，16（10）：589-604.

[2]  Lee HW，Cho KJ，Park JY. Current Status and Future Direction of Immunotherapy in Hepatocellular Carcinoma：What Do the Data Suggest？ [J]. Immune Netw，2020，20（1）：e11.

[3]  Akinyemiju T，Abera S，Ahmed M，et al. The Burden of Primary Liver Cancer and Underlying Etiologies From 1990 to 2015 at the Global，Regional，and National Level：Results From the Global Burden of Disease Study 2015 [J]. JAMA Oncol，2017，3（12）：1683-1691.

[4]  Kim BH，Park JW. Epidemiology of liver cancer in South Korea [J]. Clin Mol Hepatol，2018，24（1）：1-9.

[5]  Lee JS，Cho IR，Lee HW，et al. Conditional Survival Estimates Improve Over Time for Patients with Hepatocellular Carcinoma：An Analysis for Nationwide Korea Cancer Registry Database [J]. Cancer Res Treat，2019，51（4）：1347-1356.

[6]  Wang D，Luo L，Chen W，et al. Significance of the vascular endothelial growth factor and the macrophage migration inhibitory factor in the progression of hepatocellular carcinoma [J]. Oncol Rep，2014，31（3）：1199-1204.

[7]  Niu G，Chen X. Vascular endothelial growth factor as an anti-angiogenic target for cancer therapy [J]. Curr Drug Targets，2010，11（8）：1000-1017.

[8]  Zhang W，Kim R，Quintini C，et al. Prognostic role of plasma vascular endothelial growth factor in patients with hepatocellular carcinoma undergoing liver transplantation [J]. Liver Transpl，2015，21（1）：101-111.

[9]  Syed YY. Ramucirumab：A Review in Hepatocellular Carcinoma [J]. Drugs，2020，80（3）：315-322.

[10]  Medavaram S，Zhang Y. Emerging therapies in advanced hepatocellular carcinoma [J]. Exp Hematol Oncol，2018， 7：17.

[11]  Li TY，Yang Y，Zhou G，et al. Immune suppression in chronic hepatitis B infection associated liver disease：A review [J]. World J Gastroenterol，2019，25（27）：3527-3537.

[12]  Villanueva A. Hepatocellular Carcinoma [J]. N Engl J Med，2019，380（15）：1450-1462.

[13]  Lou W，Liu J，Gao Y，et al. MicroRNA regulation of liver cancer stem cells [J]. Am J Cancer Res，2018，8（7）：1126-1141.

[14]  Kim DW，Talati C，Kim R. Hepatocellular carcinoma（HCC）：beyond sorafenib-chemotherapy [J]. J Gastrointest Oncol，2017，8（2）：256-265.

[15]  Kirstein MM，Wirth TC. Multimodal treatment of hepatocellular carcinoma [J]. Internist：Berl，2020，61（2）：164-169.

[16]  Zhu AX，Duda DG，Sahani DV，et al. HCC and angiogenesis：possible targets and future directions [J]. Nat Rev Clin Oncol，2011，8（5）：292-301.

[17]  Bangaru S，Marrero JA，Singal AG. Review article：new therapeutic interventions for advanced hepatocellular carcinoma [J]. Aliment Pharmacol Ther，2020，51（1）：78-89.

[18]  Rossetto A，Re VD，Steffan A，et al. Carcinogenesis and Metastasis in Liver：Cell Physiological Basis [J]. Cancers：Basel，2019，11（11）：1731.

[19]  Terme M，Colussi O，Marcheteau E，et al. Modulation of immunity by antiangiogenic molecules in cancer [J]. Clin Dev Immunol，2012，2012：492920.

[20]  Rivera LB，Meyronet D，Hervieu V，et al. Intratumoral myeloid cells regulate responsiveness and resistance to antiangiogenic therapy [J]. Cell Rep，2015，11（4）：577-591.

[21]  Gabrilovich DI，Ostrand-Rosenberg S，Bronte V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours [J]. Nat Rev Immunol，2012，12（4）：253-268.

[22]  Voron T，Colussi O，Marcheteau E，et al. VEGF-A modulates expression of inhibitory checkpoints on CD8+ T cells in tumors [J]. J Exp Med，2015，212（2）：139-148.

[23]  Kudo M. Scientific Rationale for Combined Immunotherapy with PD-1/PD-L1 Antibodies and VEGF Inhibitors in Advanced Hepatocellular Carcinoma [J]. Cancers：Basel，2020，12（5）：1089.

[24]  Hato T， Zhu AX， Duda DG. Rationally combining anti-VEGF therapy with checkpoint inhibitors in hepatocellular carcinoma [J]. Immunotherapy，2016，8（3）：299-313.

[25]  Cheng AL，Hsu C，Chan SL，et al. Challenges of combination therapy with immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma [J]. J Hepatol，2020，72（2）：307-319.

（收稿日期：2020-05-26）