，，，，，，，

（1.广东农工商职业技术学院，广东 广州 510507；2.华南农业大学 a.林学与风景园林学院；b.广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；3.中国科学院华南植物园，广东 广州 510650；4.佛山科技学院，广东 佛山 528231）

光合作用是植物维持生命的最基本活动，是其对干旱胁迫响应最敏感的生理过程之一[1]。干旱胁迫能破坏植物的水分代谢，导致叶绿素分解，影响光能电子传递和转换、光合磷酸化及暗反应等一系列过程，使得植物光合速率下降，严重时还可导致叶绿体光合机构的破坏[2]，对植物体造成不可逆影响。叶绿素荧光参数对干旱胁迫的响应非常灵敏[3]，能够作为干旱胁迫监测的内在敏感指标，密切监测光合作用过程中光能的吸收、传递、耗散和分配[4]。目前，叶绿素荧光技术已成为检测植物耐干旱胁迫能力的有效手段，并在黑麦草Lolium perenne[5]、金银花Lonicera japonica[6]、番茄Solanum lycopersicum[7]、黑果枸杞Lycium ruthenicum[8]和栓皮槭Acer campestre[9]等植物的耐干旱胁迫研究中得以应用。

油茶Camellia oleifera是中国特有的耐干旱、耐贫瘠木本油料经济作物，现已选育出众多优良品种，但各品种的抗旱性存在差异[10]。当前，针对油茶抗旱性的研究主要集中在形态结构[11]、渗透调节物质[12]、保护酶系统[13]、内源激素[14]、光合参数[15]和转录组[16]等方面，针对油茶叶绿素荧光的研究主要集中在各品种的基本荧光特性[17]、营养元素吸收[18]及外源激素响应[19]等方面。应用叶绿素荧光技术开展油茶抗旱性研究的报道较为鲜见，仅见刁兆龙[20]报道了干旱胁迫下1年生‘闽43’油茶苗的叶绿素荧光参数变化规律，及油茶对干旱胁迫的响应。本研究中借助叶绿素荧光检测技术，探讨干旱胁迫和复水后广西4 个油茶优良品种叶绿素含量及叶绿素荧光参数的变化规律，并采用隶属函数法和聚类分析法综合评价其抗旱能力，以期筛选出高光效抗旱油茶种质，为后续油茶耐旱品种选育和引种栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试苗木

以华南地区广泛栽培的岑软2号、岑软3号、桂无1号和桂无4号1年生油茶嫁接苗为试验材料。所有苗木均产自广东农垦热带作物科学研究所，引回后统一培育在华南农业大学经济林研究中心苗圃。将苗木移植入育苗袋（12 cm×8 cm）中，6 个月后挑选生长一致的健壮植株进行试验。幼苗情况详见表1。

1.2 试验设计

干旱胁迫及复水处理均在人工气候室（BIC-250）内进行。光照强度调控在2 500 lx，给予光照14 h 和黑暗10 h 的光周期，温度控制在（25±2）℃，湿度控制在75%～85%。将根部土壤洗净，固定在3 个装有新鲜1/2 Hoagland 营养液的培养槽中缓苗2 d。随后，将5 L 新鲜1/2 Hoagland 营养液和不同量PEG 6000 配制的处理液倒入培养槽进行干旱胁迫处理。

表1 供试油茶幼苗基本生长情况Table1 Basic characteristics of tested seedlings in C.oleifera cm

共设置3 个胁迫强度，分别为100 g/L PEG 6000（轻度胁迫）、200 g/L PEG 6000（中度胁迫）和300 g/L PEG 6000（重度胁迫），以不添加PEG 6000 为对照。每个胁迫处理设4 个时间点，包括12、24、36 h，以及36 h 后将胁迫处理液置换成5 L 的1/2 Hoagland 营养液进行复水12 h 处理。

1.3 指标测定

1.3.1 叶绿素含量的测定

采用分光光度法测定叶绿素a 和叶绿素b 的含量。将油茶叶去掉中脉后剪碎混合，称量0.5 g碎样放入干燥研钵，加入液氮快速研磨至粉末。先后加入2 和5 mL 80%的丙酮，继续研磨成匀浆状后静置3 min，将匀浆全部转入25 mL 棕色容量瓶，并用80%丙酮定容，充分摇匀静置24 h。将提取液倒入管径为10 mm 的比色皿，以80%丙酮为空白对照。将分光光度计的波长设置为645 和663 nm，分别测定其吸光值。将所测吸光值代入以下公式计算叶绿素含量。

式中：Ca表示叶绿素a 含量；Cb表示叶绿素b 含量；D663表示波长663 nm 处的吸光值；D645表示波长645 nm 处的吸光值。

1.3.2 叶绿素荧光参数的测定

采用脉冲调制荧光仪OS-1P（OPTI，USA）测定叶绿素荧光参数。每个处理随机挑选5 株健壮植株，在每株第4 ～6 枚功能叶间随机选定1枚生长成熟、长势良好、无病虫害的叶片挂牌标记，进行在体测试。经过充分光适应后，在暗处进行20 min 暗适应，选择非光化学淬灭（NPQ）模式，测定PS Ⅱ非调节性能量耗散（YNO）、PS Ⅱ调节性能量耗散（YNPQ）、非光化学淬灭（NPQ）。每次测定时间为1 min，每枚叶片进行3 次叶绿素荧光参数测定，取平均值。计算表观电子传递速率（ETR）和实际光量子效率（YPSⅡ）。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel 2016 和SPSS 17.0 软件进行统计分析和图像处理。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对油茶叶片叶绿素含量的影响

2.1.1 对油茶叶片叶绿素a 含量的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片叶绿素a 含量的影响如图1所示。由图1可见，桂无4号叶片叶绿素a 含量随干旱胁迫时间延长而持续下降，其余3 个品种叶片叶绿素a 含量波动较小。干旱胁迫36 h 时，仅桂无4号叶片叶绿素a 含量显著低于对照（P＜0.05），其余品种所有处理与对照间差异性不显著或显著高于对照。在胁迫过程中，岑软2号叶片叶绿素a 含量较其余3 个品种高，表明在同等胁迫条件下岑然2号叶片能维持更高的叶绿素a 含量。复水处理后，除桂无1号轻度胁迫处理中叶片叶绿素a 含量小幅升高，其余处理均降低。

2.1.2 对油茶叶片叶绿素b 含量的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片叶绿素b 含量的影响如图2所示。由图2可见，干旱胁迫初期（胁迫0、12、24 h），桂无1号和桂无4号叶片叶绿素b 含量高于岑软2号和岑软3号。干旱胁迫36 h时，桂无1号和桂无4号叶片叶绿素b 含量快速降低，且显著低于对照（P＜0.05）。在整个试验过程中，岑软2号和岑软3号叶片叶绿素b 含量稳定，各强度干旱胁迫36 h 时的叶绿素b 含量均高于对照。复水后，岑软2号和岑软3号叶片叶绿素b 含量显著降低（P＜0.05），桂无1号和桂无4号叶片叶绿素b 含量变化不显著。

2.2 干旱胁迫对油茶叶片叶绿素荧光参数的影响

2.2.1 对油茶叶片ETR 的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片ETR 的影响如图3所示。由图3可见，受干旱胁迫影响，桂无1号和桂无4号叶片ETR 逐步下降，且降幅明显。岑软2号和岑软3号叶片ETR 在胁迫持续12 h时降低，胁迫持续24 h 时达峰值，胁迫持续36 h时又显著下降，呈波动变化，但始终维持在较大值，而且在胁迫后期明显高于桂无1号和桂无4号。复水处理12 h 时，除在轻度胁迫处理中岑软2号和岑软3号叶片ETR 恢复至对照水平，其余处理ETR 仍然显著低于对照（P＜0.05），与对照的ETR 差值随胁迫增强而增大。

图1 干旱胁迫对油茶叶片叶绿素a 含量的影响Fig.1 Effect of drought stress on chlorophyll a content

图2 干旱胁迫对各品种油茶叶片叶绿素b 含量的影响Fig.2 Effect of drought stress on chlorophyll b content

2.2.2 对油茶叶片YPS Ⅱ的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片YPSⅡ的影响如图4所示。由图4可见，4 个油茶品种叶片YPSⅡ变化幅度随胁迫的增强而增大，岑软系列2 个品种YPSⅡ均较桂无系列2 个品种大。干旱胁迫导致桂无1号和桂无4号叶片YPSⅡ随胁迫时间延长而逐渐下降，且降幅明显。岑软2号和岑软3号叶片YPSⅡ呈现“降低—升高—降低”的波动变化趋势。复水后，轻度胁迫处理中岑软2号叶片YPSⅡ显著升高，重度胁迫处理中岑软3号和轻度胁迫处理中桂无4号叶片YPSⅡ显著下降（P＜0.05），其余各处理差异不显著。

图3 干旱胁迫对各品种油茶叶片表观电子传递速率（ETR）的影响Fig.3 Effect of drought stress on electron transport rate (ETR)

图4 干旱胁迫对各品种油茶叶片实际光量子效率（YPS Ⅱ）的影响Fig.4 Effect of drought stress on active quantum efficiency of PS Ⅱ (YPS Ⅱ)

2.2.3 对油茶叶片NPQ 的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片NPQ 的影响如图5所示。由图5可见，在试验过程中，岑软2号和岑软3号的NPQ 增幅较桂无1号和桂无4号大。胁迫初期（胁迫0、12、24 h），各胁迫强度下桂无1号叶片NPQ 持续下降，桂无4号叶片NPQ 波动变化，胁迫持续36 h 时桂无系列2 个品种叶片NPQ 均升高，其中轻度胁迫和中度胁迫处理下叶片NPQ 显著高于对照，重度胁迫处理下显著低于对照。岑软2号和岑软3号叶片NPQ随胁迫时间的延长而显著升高，所有处理在胁迫持续24 h 时叶片NPQ 均达到峰值，胁迫持续36 h时显著下降（P＜0.05）。复水12 h 时，轻度胁迫处理下桂无1号和桂无4号叶片NPQ 显著降低（P＜0.05），其余处理差异不显著。

2.2.4 对油茶叶片YNPQ 的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片YNPQ的影响如图6所示。由图6可见，干旱胁迫持续12 和24 h时，桂无1号叶片YNPQ持续下降，轻度胁迫持续36 h 时叶片YNPQ显著高于对照（P＜0.05），而中度胁迫和重度胁迫处理下叶片YNPQ与对照差异不显著。各处理中，随胁迫时间延长，桂无4号叶片YNPQ呈现“升高—降低—升高”的波动变化，轻度胁迫和中度胁迫持续36 h 时叶片YNPQ显著高于对照（P＜0.05），重度胁迫处理下叶片YNPQ与对照差异不显著；岑软2号和岑软3号叶片YNPQ随胁迫时间延长而增加，且于胁迫持续24 h 时达峰值，胁迫持续36 h 时显著下降（P＜0.05）。复水处理12 h 时，除轻度胁迫和重度胁迫处理下桂无1号及轻度胁迫处理下岑软2号叶片YNPQ显著低于对照外，其余处理与对照差异不显著。

图5 干旱胁迫对各品种油茶叶片非光化学淬灭（NPQ）的影响Fig.5 Effect of drought stress on non-photochemical quenching (NPQ)

图6 干旱胁迫对各品种油茶叶片PS Ⅱ调节性能量耗散（YNPQ）的影响Fig.6 Effect of drought stress on quantum yield of regulated energy dissipation (YNPQ)

2.2.5 干旱胁迫对油茶叶片YNO 的影响

干旱胁迫对各品种油茶叶片YNO的影响如图7所示。由图7可见，随着干旱胁迫的持续，胁迫持续12、24 h 时岑软2号和岑软3号叶片YNO逐渐降低，桂无1号和桂无4号叶片YNO逐渐升高，这种变化趋势导致胁迫初期岑软2号和岑软3号叶片YNO低于桂无1号和桂无4号。但是胁迫持续36 h 时，除重度胁迫处理下桂无1号、桂无4号和岑软3号叶片的YNO值显著高于对照（P＜0.05），其余处理与对照差异不显著。复水12 h 时，轻度胁迫处理下桂无1号和桂无4号，及重度胁迫处理下岑软3号叶片YNO显著升高（P＜0.05），其余处理变化不显著。

2.3 油茶抗旱性的综合评价

2.3.1 隶属函数分析

隶属函数法能在多指标基础上反映植物的抗旱性[21]，能较为全面综合地反映植物的真实抗旱能力。采用叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、表观电子传递速率、实际光量子效率、非光化学淬灭、PS Ⅱ调节性能量耗散、PS Ⅱ非调节性能量耗散共7 个生理指标进行油茶抗旱性隶属函数分析。结果显示（表2），4 个油茶品种按照其抗旱性由强到弱排序依次为岑软2号、岑软3号、桂无1号、桂无4号。

图7 干旱胁迫对各品种油茶叶片PS Ⅱ非调节性能量耗散（YNO）的影响Fig.7 Effect of drought stress on quantum yield of non-regulated energy dissipation (YNO)

表2 干旱胁迫下4 个油茶品种叶绿素含量和叶绿素荧光参数的隶属函数值及抗旱性排序Table2 The subordinate function values and anti-drought order of four cultivars under different drought intensity

2.3.2 聚类分析

基于4 个油茶品种的叶绿素a 含量、叶绿素b含量、表观电子传递速率、实际光量子效率、非光化学淬灭、PS Ⅱ调节性能量耗散、PS Ⅱ非调节性能量耗散，采用欧氏距离法及系统聚类法对各生理指标进行系统聚类（图8）。结果显示，4 个油茶品种可被划分为2 大类群，其中桂无1号和桂无4号归为一个类群，抗旱能力较弱；岑软2号和岑软3号归为一个类群，抗旱能力较强。

图8 基于抗旱性的各油茶品种聚类结果Fig.8 Drought resistance clustering analyses of different C.oleifera cultivars

3 结论与讨论

本研究中对4 个油茶品种在不同强度干旱胁迫及复水处理处理下的叶绿素a 含量、叶绿素b含量、表观电子传递速率（ETR）、实际光量子效率（YPSⅡ）、非光化学淬灭（NPQ）、PS Ⅱ调节性能量耗散（YNPQ）、PS Ⅱ非调节性能量耗散（YNO）共7 个指标进行动态监测，采用隶属函数法和聚类分析法对其抗旱性进行综合评价。结果显示，岑软2号和岑软3号的抗旱性较强，属耐旱品种；桂无1号和桂无4号抗旱性较弱，属干旱敏感品种。4 个油茶品种按照其抗旱性由强到弱排序依次为岑软2号、岑软3号、桂无1号、桂无4号。

叶绿素a 和叶绿素b 是叶绿素的主要组成成分，是植物重要的光合色素[22]。叶绿素a 主要吸收长波光，叶绿素b 主要吸收短波光。干旱胁迫会导致植物叶片光合色素含量降低，影响植物对光能的正常吸收，影响后续光能的传递、耗散和分配，直接导致叶绿素荧光参数的变化，破坏光合作用的正常进行。本研究中，在不同强度干旱胁迫下，岑软2号和岑软3号均能维持稳定的叶绿素a 和叶绿素b 含量，表明其在干旱条件下具有较强的光能吸收能力，较能适应胁迫环境；桂无4号叶片叶绿素a 和叶绿素b 含量，及桂无1号叶片叶绿素b 含量随胁迫持续而显著下降，表明干旱胁迫导致其光合色素分解，影响光合作用的正常进行。

ETR反映实际光强下的光合能量传递速率[23]，YPSⅡ反映光化学反应消耗的能量比例，是植物实际光合效率的体现[24]，均是植物光合作用的正向指标。桂无1号和桂无4号叶片ETR 和YPSⅡ随干旱胁迫持续而显著下降，表明干旱胁迫对其正常光合作用造成了明显伤害。ETR 降低表明干旱胁迫引起了捕光天线和反应中心结构的变化，导致PS Ⅱ电子传递受阻；YPSⅡ降低显示干旱胁迫引起其实际光化学转化效率下降，降低了碳反应中的CO2同化能力[25]，抑制了植物光呼吸及依赖O2的电子流[26]。在胁迫初期，岑软2号和岑软3号叶片的ETR 和YPSⅡ均降低，但在胁迫持续24 h 时快速升高且大部分处理显著高于对照，表明这2 个品种能及时适应干旱环境，维持正常的光合作用，以保证其生命代谢的正常进行[27-28]。此结果与李得禄等[29]对青海云杉Picea crassifolia和沙地云杉Picea mongolica，以及胡宏远等[30]对赤霞珠葡萄Cabernet Sauvignon 的研究结果类似。在整个胁迫过程中，岑软2号和岑软3号叶片ETR 和YPSⅡ均能维持在较高水平，表明其抗旱性比桂无系列2 个品种强。

如果PS Ⅱ吸收的光能超过其吸收范围，会造成植物光合系统的破坏。NPQ 和YNPQ是反映植物以热形式耗散的不能用于光合电子传递的多余光能，多余光能的热耗散是植物的重要保护形式[31-33]。在胁迫初期，岑软系列2 个品种叶片NPQ 和YNPQ迅速增大且于胁迫持续24 h 时达到峰值，胁迫持续36 h 时其值显著下降至对照水平，表明这2 个品种通过自身调节机制快速消耗过剩光能以保护光合系统[34]，适应了干旱环境。在轻度胁迫和中度胁迫下，桂无1号和桂无4号叶片NPQ 和YNPQ在胁迫初期降低，胁迫持续36 h 时其值迅速增大且达到峰值，重度胁迫下叶片NPQ 和YNPQ随胁迫持续而降低，表明桂无1号和桂无4号在轻度胁迫和中度胁迫条件下仍具有一定的热耗散调节能力，但在重度胁迫条件下，已不能进行正常光能热耗散，难以适应胁迫环境。

YNO反映植物光合系统因光钝化引起的非调节性量子产量，是光损伤的负评价指标[35]。本研究中，桂无1号和桂无4号在胁迫持续12 和24 h 时叶片YNO持续增加，表明其在胁迫初期已达到光能消耗极限，积累的过剩光能可能传递给O2，形成破坏性极大的单线态氧（1O2），导致光合机构失活。岑软2号和岑软3号叶片YNO在胁迫持续24 h 时显著降低，且在整个试验过程中各处理叶片YNO均未明显高于对照，表明其在干旱胁迫下通过自身调节增强了光能消耗能力，有效保护了光合系统，更适应干旱胁迫环境。

进行复水处理解除胁迫后，桂无1号和桂无4号叶片叶绿素a 和叶绿素b 含量这2 个光合色素指标变化不显著，ETR、YPSⅡ、YNO、NPQ 和YNPQ等叶绿素荧光生理指标无恢复迹象，表明桂无系列2 个品种的旱后恢复能力较弱，干旱胁迫初期已对其产生较大伤害。而岑软2号和岑软3号各指标出现不同程度正向恢复，尤其是在轻度胁迫下，ETR、YPSⅡ、YNO、NPQ 和YNPQ等叶绿素荧光生理指标恢复至对照水平，表明其具有良好的旱后恢复能力，在胁迫解除后能快速恢复正常生长。

本研究中，4 个油茶品种叶片叶绿素含量和叶绿素荧光参数均发生显著变化，结果表明干旱胁迫有效引起了油茶的应激生理反应。但是，本研究中仅从油茶幼苗叶绿素和叶绿素荧光生理层面了解油茶对干旱胁迫的响应机制，对于油茶抗旱机理的研究不够全面，只有对更多油茶品种进一步开展生理生化指标、光合生理指标、植物解剖结构、分子生物学等多方面的综合研究，才能更深入全面地了解油茶的抗旱机理。