杨 成，封肖颖，孙嵇成，庞月红

(江南大学 食品学院 江苏 无锡 214122)

多环芳烃(PAHs)是一类有机污染物，对人体具有潜在的致癌性和致畸性，持久性地广泛存在于水、食物和土壤中，可以经过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径进入体内，易在生物体内蓄积[1-3]。1-羟基芘(1-OHP)是多环芳烃的主要代谢产物之一，因该物质在人体尿液中能较好地反映PAHs的暴露情况，一直被作为研究PAHs暴露的生物标记物[4-5]，其含量的测定具有十分重要的意义。有研究发现随着宫颈病变程度的加重，人体尿中1-羟基芘浓度及高暴露率升高[6]。

1-羟基芘的检测方法有高效液相色谱法[7]、液相色谱/气相色谱与质谱联用法[8-10]、电喷雾萃取电离质谱法[11]、光谱法等[12]，这些方法检测灵敏，但所需的设备价格昂贵，对操作人员的要求严格。而电化学方法由于灵敏度高、成本低、速度快、操作方便等优点，在分析检测中得到了广泛关注[13-14]。

石墨烯是一种sp2轨道杂化的二维碳纳米结构，具有良好的导电性能和力学性能[15]。石墨烯的电子迁移率大，电阻率小，导电性能良好，将其作为修饰电极应用于小分子的检测受到越来越多的关注[16]。马玲等[17]通过滴涂法将石墨烯溶液滴至玻碳电极表面，室温下自然晾干，利用循环伏安法(CV)建立了维生素B12的检测方法。Wang等[18-19]通过电还原氧化石墨烯修饰电极，在抗坏血酸(AA)存在下实现了多巴胺的检测。Sharma等[20]在石墨烯上负载Pt纳米粒子，增加了对有机小分子的电催化氧化能力。笔者课题组[21]采用蒽和喹啉单元中的Suzuki偶联反应合成了一种共轭聚合物聚-8-甲氧基-7-甲基-5-(10-蒽-9-基)喹诺酮(PMMAYQ)，并基于均相可控的{PMMAYQ-石墨烯}n多层膜研制了一种灵敏的1-羟基芘电化学传感器。本文以氧化石墨烯和氯铂酸混合液为前躯体，采用一步电沉积法制备了纳米铂/还原氧化石墨烯修饰电极(Pt/E-rGO/GCE)，并采用CV法研究了1-羟基芘在该修饰电极上的电化学行为，并利用差分脉冲伏安法(DPV)实现了对1-羟基芘的定量检测(如图1)。

图1 Pt/E-rGO/GCE 制备过程及其原位富集传感1-羟基芘示意图Fig.1 Schematic diagram of Pt/E-rGO/GCE preparation and in situ enrichment sensing for 1-hydroxypyrene

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；FE20K精密pH计(梅勒-托莱登斯特有限公司)；Centrifuge 5810R型台式离心机(德国艾本德公司)；Milli-Q Integral Cabinet 3超纯水系统(美国密里博公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。氧化石墨烯(南京先丰纳米材料科技有限公司)；氯铂酸(H2PtCl6，纯度≥99.9%)，1-羟基芘(纯度≥98%)，高氯酸钠、铁氰化钾、亚铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氯化钾、甲醇、乙醇、醋酸、醋酸钠(分析纯)，上述试剂均购于上海百灵威化学技术有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 纳米铂-石墨烯修饰电极的制备

用0.05 μm的氧化铝在麂皮上将玻碳电极抛光至镜面，用水冲洗后，再依次用硝酸-水(1∶3)溶液、乙醇溶液和水超声清洗各1 min，氮气吹干，处理好的电极备用。称取10 mg氧化石墨烯(GO)溶解于10 mL水中，超声分散1 h，加入一定质量H2PtCl6和H2SO4，配成1 mg/mL氧化石墨烯、1 mmol/L H2PtCl6和0.5 mol/L H2SO4的混合液，继续超声分散1 h，作为电沉积液。将处理好的玻碳电极插入上述电沉积液中，采用CV法扫描，扫描范围为-1.4～0.6 V，扫描速率为50 mV/s，一步电沉积法制备得到纳米铂/还原氧化石墨烯(Pt/E-rGO)修饰电极。

1.3 样品处理

收集匿名志愿者尿样于棕色瓶中，在-20 ℃下避光保存。测试前，在室温下解冻，摇匀，取10 mL样品于50 mL锥形瓶中，加入20 μLβ-葡萄糖醛酸酶和5 mL pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混合均匀后，37 ℃下恒温酶解2 h，离心，吸取上清液，加入5 mL正己烷萃取2次，弃去上清液，合并下清液。氮气吹干后，重新溶解于2 mL PBS缓冲液中，备用。

2 结果与讨论

2.1 Pt/E-rGO材料的表征

图3 不同电极在0.5 mol/L H2SO4中的循环伏安曲线Fig.3 CV curves of different electrodes in 0.5 mol/L H2SO4a：GCE；b：E-rGO/GCE；c：Pt/GCE；d：Pt/E-rGO/GCE

2.2 Pt/E-rGO/GCE的电化学行为

Pt/E-rGO/GCE在0.5 mol/L H2SO4溶液中的CV曲线如图3所示，与裸GCE和E-rGO/GCE相比，Pt/E-rGO/GCE的CV曲线可观察到明显的峰，且峰形与Pt/GCE的相似，均分别在0.5 V和0.9～1.2 V处出现明显的Pt的氧化还原特征峰，表明Pt已修饰至电极表面。

分别将裸GCE电极、E-rGO/GCE、Pt/E-rGO/GCE与Pt/GCE置于1 mmol/L 铁氰化钾/亚铁氰化[Fe(CN)6]3-/4-(含0.2 mol/L KCl)溶液中，使用阻抗法及CV法对修饰电极的电化学性能进行表征。

如图4A所示，裸GCE、Pt/GCE、E-rGO/GCE与Pt/E-rGO/GCE的阻抗逐渐变大，表明在电极上修饰了纳米铂、石墨烯材料后，其电阻增大。而从[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的氧化还原反应(图4B)可以看出，裸GCE、Pt/GCE、E-rGO/GCE与Pt/E-rGO/GCE的峰电流值依次增大，表明Pt/E-rGO/GCE的氧化还原电流增强可能是由于电极比表面积增大所致。

2.3 1-羟基芘在Pt/E-rGO/GCE上的电化学性质

采用CV法，在含200 nmol/L 1-羟基芘的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，对裸GCE、E-rGO/GCE与Pt/E-rGO/GCE进行扫描，结果如图5(a、b、c)所示，利用GCE对1-羟基芘进行检测时，无明显的氧化还原峰出现；利用E-rGO/GCE对1-羟基芘进行检测时，氧化还原峰电流显著增加，峰电位差缩小至35 mV；利用Pt/E-rGO/GCE对1-羟基芘进行检测时，由于纳米铂和石墨烯的协同作用使得电极具有良好的催化活性与极大的电子传导率，使1-羟基芘的氧化还原峰电流达到最大值，峰电位差缩小至64 mV。

图5 3种不同电极在200 nmol/L 1-羟基芘中的CV曲线(a～c)及 Pt/E-rGO/GCE在PBS溶液中的CV曲线(d)Fig.5 CV curves of three different electrodes in 200 nmol/L 1-hydroxypyrene(a-c) and Pt/E-rGO/GCE in PBS solution(d)a：GCE；b：E-rGO/GCE；c：Pt/E-rGO/GCE

利用Pt/E-rGO/GCE进一步考察了空白PBS的CV曲线。结果显示，在空白PBS溶液中无氧化还原峰(图5d)，而在200 nmol/L 1-羟基芘溶液中有明显的氧化还原峰(图5c)。此现象表明，将Pt/E-rGO/GCE用于1-羟基芘的检测，可极大地提高检测灵敏度。

2.4 扫描速率的影响

采用CV法，考察了扫描速率(10～100 mV/s)对1-羟基芘氧化还原峰电流的影响。结果显示，随着扫描速率的增加，1-羟基芘的氧化还原峰电流强度逐渐增强，且与扫描速率在10～100 mV/s范围内呈现良好的线性关系，线性方程分别为：Ipc(μA)=0.270 0v+3.800(mV/s)(r2=0.980)，Ipa(μA)=-0.308 0v+2.881(mV/s)(r2=0.973)，表明1-羟基芘在Pt/E-rGO/GCE表面是一个吸附控制过程。

2.5 电解液pH值的影响

2.6 电沉积圈数的影响

在1-羟基芘的检测过程中，1-羟基芘的还原峰电流与电极上电沉积Pt/E-rGO的圈数有关。利用Pt/E-rGO/GCE，通过差分脉冲伏安法对200 nmol/L的1-羟基芘进行测试。结果显示，在3～5圈内，随着电沉积圈数的增大，1-羟基芘的还原峰电流逐渐增大，当电沉积圈数大于5圈后，由于制得的Pt/E-rGO膜过厚，降低了电子传导率，1-羟基芘的还原峰电流开始下降。所以，选取5圈作为最佳电沉积圈数。

2.7 1-羟基芘的定量检测

在上述优化条件下，采用Pt/E-rGO/GCE修饰电极通过DPV法对不同浓度的1-羟基芘进行测试，结果如图7所示。随着1-羟基芘浓度的增加，其在0.3 V电位下获得的还原电流值逐渐增强，且在50～700 nmol/L范围内，1-羟基芘的浓度(c1-OHP,nmol/L)与其还原峰电流(ΔI,μA)呈现良好的线性关系，线性方程为ΔI(μA)= 0.185c1-OHP+19.821(nmol/L)，相关系数(r)为0.976，检出限(S/N=3)为12.1 nmol/L。

图6 pH值对1-羟基芘氧化还原峰电流的影响Fig.6 Influence of pH value on peak current of 1-hydroxypyrene raluepH value(a-g):2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0;insert:relationship between apparent

图7 不同浓度1-羟基芘在Pt/E-rGO/GCE上的DPV图Fig.7 DPV curves of different concentrations of 1-hydroxypyrene on Pt/E-rGO/GCEconcentration of 1-hydroxypyrene(a-k):0，50，100，150，200，250，300，400，500，600，700 nmol/L；insert:relationship between DPV response current and 1-OHP concentration

图8 Pt/E-rGO/GCE在1-羟基芘(a)和UA+1-羟基芘(b)中的循环伏安曲线Fig.8 CV curves of Pt/E-rGO/GCE in 1-hydroxypyrene(a) and UA+1-hydroxypyrene (b)

2.8 Pt/E-rGO/GCE的稳定性、重现性与选择性

采用5支Pt/E-rGO/GCE在含500 nmol/L 1-羟基芘的PBS溶液中连续测定，测得5支电极还原峰电流响应值的相对标准偏差(RSD)为4.4%。将修饰电极于室温下放置10 d后在相同条件下测试，其响应值为初始值的90.6%。表明该修饰电极对1-羟基芘的检测具有良好的稳定性和重现性。

2.9 尿液样品中1-羟基芘的测定

将健康志愿者尿样按照“1.3”方法进行预处理后，用本文制备的电化学传感器进行测定，尿液中未检出1-羟基芘，判定为阴性。在此尿液样品中加入3个浓度水平(75、300、500 nmol/L)的1-羟基芘，进行加标回收实验，每个加标水平平行测定5次。结果表明，尿样中1-羟基芘在低、中、高3个加标水平下的平均加标回收率分别为99.7%、104%、108%，RSD分别为3.4%、4.3%、3.2%。表明本文构建的电化学传感器可用于实际样品的检测。

3 结 论

本文采用一步电沉积法制备了纳米铂还原氧化石墨烯修饰电极。由于纳米铂和还原氧化石墨烯的协同作用增强了电极的导电性，极大地提高了电极的灵敏度，因而较普通玻碳电极和还原氧化石墨烯修饰电极的性能更为优越。结合差分脉冲伏安法原位富集1-羟基芘，建立了电化学检测1-羟基芘的分析方法，检出限为12.1 nmol/L。该方法还具有良好的稳定性、重现性以及抗干扰性，已成功应用于人体尿液中1-羟基芘的检测。