左军凤，贺针华，2，熊马剑，朱碧君*

(1.江西省药品检验检测研究院，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004)

荧光增白剂的检测方法主要有紫外灯照射观测法[9-10]、荧光分光光度法[11-12]、液相色谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15]。紫外灯照射观测法只能定性分析荧光增白剂，不能确定其种类和含量。液相色谱法和液相色谱-串联质谱法均可用于荧光增白剂的定性和定量检测[16]。其中，液相色谱-串联质谱法虽定性准确、灵敏度高，但设备价格昂贵，维护和使用成本很高[17]。与传统的高效液相色谱法相比，超高效液相色谱法拥有更快的分析速度、更高的灵敏度和更好的分离度，可缩短分析时间，节约溶剂，降低分析成本。为了研究药用复合膜中水溶性荧光增白剂，本文采用超高效液相色谱法建立了上述7种水溶性荧光增白剂的检测方法。方法简便、快速，适用于药用复合膜样品中水溶性荧光增白剂的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

LC-30AD 超快速液相色谱仪，配PDA检测器(日本岛津公司)；MS-105电子天平(梅特勒-托利多控股有限公司)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

荧光增白剂均购自深圳市瑞吉特生物科技有限公司，7种水溶性荧光增白剂试剂分别为：5-{4，4，-双[[4-[双(2-羟基乙基)氨基]-6-(4-磺酸钠苯胺)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯乙烯-2，2，-二磺酸钠}(FWA220，批号：180106)、2，2，-(1，2-乙二基)双[5-[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-[(3-二氧苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸钠](FWA24，批号：181204)、4，4，-双(4，4，-羟乙基氨基-6-苯胺基-1，3，5-三嗪-2-氨基)二苯乙烯-2，2，-二磺酸钠(FWA113，批号：190320)、2，2，-[1，2-乙二基双[(3-磺基-1，4-亚苯基)亚氨基[6-[双(2-羟乙基)氨基]-1，3，5-三嗪-4，2-二基]亚氨基]]双(1，4-苯二磺酸)六钠盐(FWA264，批号：190204)、4，4，-双[(4-苯胺基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，二磺酸二钠(FWA134，批号：181125)、2，2，-(1，2-乙二基)双[5-[[4-(二乙氨基)-6-[(2，5-二磺苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸]六钠盐(FWA357，批号：190215)、4，4，-双[(4-苯胺基-6-吗啉基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，-二磺酸二钠盐(FWA71，批号：181112)。甲醇、乙腈(色谱纯，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)。其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

聚酯/铝/聚乙烯药用复合膜(PET/Al/PE)、聚酯/铝/聚丙烯药用复合膜(PET/Al/PP)、纸/铝/聚乙烯药用复合膜(纸/Al/PE)、玻璃纸/铝/聚乙烯药用复合膜(PT/Al/PE)、铝/聚乙烯药用复合膜(Al/PE)、聚丙烯/铝/聚乙烯药用复合膜(PP/Al/PE)、聚酯/镀铝聚酯/聚乙烯药用复合膜(PET/VMPET/PE)、双向拉伸聚丙烯/真空镀铝流延聚丙烯药用复合膜(BOPP/VMCPP)、聚酯/聚乙烯药用复合膜(PET/PE)9个品种共191批药用复合膜样品以及33批聚酯原料膜、28批聚乙烯原料膜、7批聚丙烯原料膜、5批纸原料样品，来源于国内110个生产厂家。

1.2 标准溶液的配制

称取FWA220、FWA264、FWA357各0.08 g(精确至0.1 mg)，FWA24、FWA113、FWA134、FWA71各0.02 g(精确至0.1 mg)，分别置于50 mL棕色容量瓶中，加入40%乙腈水溶液(pH 11.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为1 600 μg/mL和400 μg/mL的单标母液。分别精密移取单标母液各10 mL于100 mL棕色容量瓶中，加40%乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为160 μg/mL和40 μg/mL的混合标准储备液，用40%乙腈水逐级稀释并定容，配制系列标准使用液，其中FWA220、FWA264、FWA357的质量浓度梯度分别为160、80、40、10、8、4 μg/mL，FWA24、FWA113、FWA134、FWA71的质量浓度梯度分别为40、20、10、2.5、2、1 μg/mL,于冰箱中保存。

1.3 样品预处理

取药用复合膜样品，剪成约0.5 cm×0.5 cm的碎片，混匀后取约1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入10 mL 40%乙腈水溶液(三乙胺调至pH 11.0)，50 ℃超声水浴35 min后，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

1.4 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A为乙腈-甲醇混合溶液(2∶3，体积比)，流动相B为含10 mmo/L四丁基溴化铵(TBA)的甲醇-水溶液(5∶95,体积比)，流动相B经三乙胺调至pH 8.0后梯度洗脱，洗脱程序为：0～1 min，55%A；1～10 min，55%～50% A；10～20 min，50%～45%A；20～35 min，45%～40%A；35～50 min，40%～55%A；流速为0.2 mL/min；柱温为40 ℃；二极管检测器检测波长为350 nm；进样体积为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件的优化

2.1.1 提取方式的选择采用阳性样品比较了热水提取、振荡提取、室温超声提取和加热超声提取4种提取方法对荧光增白剂(以FWA220和FWA113为例)提取率的影响。结果表明样品中含有的FWA220和FWA113采用加热超声提取法时提取量最大，提取效果最好，热水提取法次之，室温超声提取法更差，而振荡提取法最差，故本实验选择加热超声提取法作为最佳提取方式。

2.1.2 提取试剂的选择考察了不同提取试剂的影响。考虑到三乙胺既可调节pH值，又可起到扫尾剂的作用，本实验选择三乙胺调节提取试剂的pH值。参考王天娇等[14]在测定纸质食品包装材料中的样品处理方法，调节提取试剂至pH 11.0，并使用阴性样品加标，分别考察了提取试剂为20%、30%、40%、50%、60%乙腈水溶液以及50%甲醇、乙醇、丙酮水溶液时，7种水溶性荧光增白剂的回收率。结果表明，当提取试剂为40%乙腈水溶液时，7种水溶性荧光增白剂的回收率为70.0%～105%，优于其他提取试剂。因此，实验选择pH 11.0的40%的乙腈水溶液作为最佳提取试剂。

2.1.3 提取温度的选择使用阴性样品加标，分别在室温、30 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃下进行超声提取，计算回收率，以考察提取温度的影响。结果表明，在50 ℃加热超声下，7种水溶性荧光增白剂的回收率为80.0%～101%，优于其他提取温度。因此，本实验选择50 ℃进行加热超声。

2.1.4 提取时间的选择使用阴性样品加标，50 ℃加热超声情况下，考察了提取时间分别为1、5、10、25、35、45 min时，7种水溶性荧光增白剂的回收率。结果表明，提取时间为35 min时，7种水溶性荧光增白剂的回收率为80.0%～101%，优于其他提取时间。因此，本实验选择超声提取35 min。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择为了使分离效果达到最佳，考察了ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Inertsil ODS-3柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)、CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Eclipse XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)、ACQUITY UPLC Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)6种色谱柱的分离效果。结果表明，ACQUITY UPLC BEH C18柱可将7种荧光增白剂分离完全，而其余色谱柱无法将各组分分离完全。故选择ACQUITY UPLC BEH C18柱进行分离。

2.2.2 柱温的选择分别考察了不同温度(25、30、35、40 ℃)对分离效果的影响。结果表明，柱温为40 ℃时分离效果最好。因此，实验选择最佳柱温为40 ℃。

2.2.3 有机相的洗脱在同样的梯度洗脱条件和离子对试剂浓度下，对比了乙腈与甲醇为有机相时对7种荧光增白剂洗脱能力的差异，结果表明，分别使用乙腈和甲醇时，7种荧光增白剂的分离效果均不佳。基于该结果，进一步考察了不同比例乙腈-甲醇混合溶剂对目标物的洗脱作用。结果表明，乙腈-甲醇体积比为1∶1时，分离效果不理想；而体积比为2∶3时，7种荧光增白剂的分离度大于1.5。因此，实验确定乙腈-甲醇(2∶3)为最佳有机洗脱相。

2.2.4 TBA浓度的影响采用乙腈-甲醇(2∶3)为流动相A，pH 8.0的甲醇-水(5∶95)溶液为流动相B，考察了流动相B中加入TBA浓度分别为5、10、25 mmol/L时荧光增白剂的分离情况，结果表明浓度为5 mmol/L时，分离效果不好，而浓度为25 mmol/L时虽分离效果最好，但FWA71的响应值不高，且该TBA浓度对柱子的损害较大。因此，实验选择TBA的最佳浓度为10 mmo/L。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验精密吸取“1.2”配制的混合标准储备液和经“1.3”样品预处理得到的供试品(纸/铝/聚乙烯药用复合膜)溶液各10 μL，并以乙腈和甲醇为空白对照，按“1.4”色谱条件进样测定，结果见图1。由图可知，在该色谱条件下，7种水溶性荧光增白剂能达到有效的分离，理论塔板数均超过3 000，所有色谱峰的分离度均大于1.5，且空白溶剂无干扰，供试品溶液色谱峰的出峰时间和混合标准储备液一致。

2.3.2 线性关系考察按照“1.2”方法配制标准曲线溶液，按“1.4”色谱条件进行分析，进样体积为10 μL，以峰面积(x)为横坐标，质量浓度(y，μg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，计算7种水溶性荧光增白剂的线性方程和相关系数，结果如表1所示。7种水溶性荧光增白剂在各自的质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数(r)为0.998 6～0.999 7。

表1 7种水溶性荧光增白剂的回归方程、线性范围、相关系数(r)、检出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r), limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

2.3.3 定量下限与检出限取“1.2”混合标准储备液适量，倍比稀释，按“1.4”色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶1、3 ∶1 分别计算检出限(LOD)、定量下限(LOQ)，得到LOD为0.17～1.29 μg/mL，LOQ为0.55～3.85 μg/mL(见表1)。表明方法具有较好的灵敏度。

2.3.4 精密度试验精密吸取混合标准储备液10 μL，按“1.4”色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果测得7种荧光增白剂的相对标准偏差(RSD,n=6)分别为0.87%、0.55%、0.62%、0.76%、0.47%、1.1%、1.8%。表明仪器的精密度较好。

2.3.5 重复性试验取一批药用复合膜样品约1 g，平行6份，精密称定，按“1.3”方法制备供试品溶液，“1.4”色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果检出FWA220和FWA113，其余荧光增白剂未检出。FWA220和FWA113的平均含量分别为63.550 3、116.013 μg/g，RSD(n=6)分别为2.2%、3.2%。表明该方法的重现性良好。

2.3.6 稳定性试验取与“2.3.5”同一批药用复合膜样品1份，称量1 g左右，加入约相当于药用复合膜含量100%的标准溶液1份，按“1.3”方法制备供试品溶液，“1.4”色谱条件进行测定，在0、2、6、10、14、18、20、24 h分别进样1次，连续进样8次，计算平均回收率。结果表明，7种荧光增白剂的RSD值分别为2.6%、4.3%、4.2%、3.2%、4.2%、2.7%、1.4%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 加标回收率试验取与“2.3.5”同一批药用复合膜样品约1 g，共9份，精密称定，加入约相当于药用复合膜含量80%、100%、120%的标准溶液各3份，按“1.3”方法制备加标供试品溶液，“1.4”色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加标回收率。结果见表2，7种水溶性荧光增白剂在3种加标浓度下的平均回收率为83.2%～110%，相对标准偏差为4.0%～9.7%。方法的准确度和精密度均能满足测定的要求。

表2 7种水溶性荧光增白剂的加标回收率及相对标准偏差(RSD)Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

(续表2)

表3 样品的测定结果(μg/g)Table 3 Determination results of samples(μg/g)

2.4 实际样品的检测

采用所建立的方法对来源于110个生产厂家的9个复合膜品种共191批次药用复合膜样品和73批次原辅材料进行检测，结果显示，有6批药用复合膜样品检出FWA220、FWA113，有3批药用复合膜样品只检出FWA220，其余的复合膜样品均未检出荧光增白剂，2批纸原料检出FWA220和FWA113，结果见表3。

3 结 论

本文建立了超高效液相色谱同时测定药用复合膜中7种水溶性荧光增白剂的方法。该方法具有前处理简单、定量准确和灵敏度高等优点，其重现性和线性关系均能满足定量分析要求。方法已成功用于药用复合膜样品中7种水溶性荧光增白剂的常规分析。由于药用复合膜用于药品包装，应用广泛，直接影响患者的用药安全，此次检测结果表明，仍有少量的药用复合膜中检出荧光增白剂，应加强荧光增白剂的检验监管工作，本文所提供的方法可借鉴使用。