郭常川，杨书娟，刘 琦，王维剑，文松松，牛 冲，徐玉文

(山东省食品药品检验研究院 国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室 山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101)

N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)又名N-二甲基亚硝胺，具有很强的致癌、致畸和致突变毒性，在ICH M7指南中明确说明该化合物具有强致癌性[1]。根据世界卫生组织(WHO)公布的致癌物清单，NDMA属于2A类致癌物质[2]。自2018年以来，国内外多家药企涉及了缬沙坦、雷尼替丁等药品中NDMA污染事件，甚至启动了全球召回程序。2020年4月1日，美国食品药品管理局(FDA)发布公告要求制药商立即撤回所有雷尼替丁药物，涉及处方药和非处方药，这是全球针对雷尼替丁NDMA污染调查的最新重磅举措。法莫替丁化学结构中具有与雷尼替丁类似的遗传毒性、致癌性警示基团，因此很有必要对法莫替丁中的NDMA含量进行调查。

2020年5月8日，中国国家药品监督管理局(NMPA)发布了《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)》[3]，分析了药品中亚硝胺类杂质引入的原因，并规定了亚硝胺类杂质的限度控制。目前，NDMA 的检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)[4]、HPLC-化学发光检测法[5]、表面增强拉曼散射法(SERS)[6]、分子印迹聚合物电化学检测法[7]、分子印迹聚合物液质联用检测法[8]、超临界流体色谱法[9]、二维离子色谱法[10]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[11-12]、气相色谱-热能分析法[13]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[13-15]等。但这些方法主要应用于食品(饮用水、水产品、肉制品等)、化妆品和烟草行业，而药品中NDMA 检测的研究极少，目前仅有测定缬沙坦、厄贝沙坦中NDMA的文献报道[16-18]，但对雷尼替丁、法莫替丁中NDMA 的检测至今未见报道。然而，由于原料药不同，其理化性质不同导致提取方法、色谱保留行为均有差异，因此测定其它药物中NDMA的文献方法不能直接应用于法莫替丁中NDMA的测定，亟需重新开发方法。静电场轨道阱(Orbitrap)高分辨质谱技术由于其高灵敏度、高质量精度的优势，在药物杂质分析领域应用广泛[19]。本研究首次建立了用于测定法莫替丁及其制剂中NDMA含量的超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(UHPLC-Orbitrap HRMS)，样品前处理简便快速，灵敏度高、专属性强，已用于法莫替丁及其制剂中NDMA的测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色谱-质谱联用系统包括Ultimate 3000液相泵、自动进样器、柱温箱以及Orbitrap高分辨质谱部分(美国Thermo Fisher Scientific Inc.)；XCalibur 4.0软件(美国Thermo Fisher Scientific Inc.)用于质谱仪控制和数据处理；Mettler XS205型电子天平(瑞士Mettler-Toledo LLC)；Heraeus Multifuge X1R型高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific Inc.)；KQ-500 DE型温控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；THZ-82型水浴恒温振荡器(常州金坛精达仪器制造有限公司)；2 mL一次性使用无菌注射器(山东新华安得医疗用品有限公司)；13 mm、0.22 μm 微孔滤头(上海安谱实验科技股份有限公司)。

NDMA对照品(含量为99.5%，TCI公司)；甲醇、乙腈、甲酸均为HPLC级(美国Thermo Fisher Scientific Inc.)；实验用纯水(18.2 MΩ·cm)由Millipore Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Merckmillipore Inc.)制得。11批法莫替丁原料、36批法莫替丁钙镁咀嚼片(每片含法莫替丁10 mg)及辅料均为药企委托检验提供。

1.2 对照品及供试品溶液的制备

1.2.1 对照品溶液取NDMA对照品适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得1.00 mg/mL的NDMA对照品储备液；精密移取上述储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀得10.00 μg/mL的对照品溶液；同法以甲醇逐步稀释，得1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00 ng/mL的系列质量浓度对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液法莫替丁供试品溶液(1.00 mg/mL)：取供试品约10 mg，精密称定，置于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀1 min使其完全溶解，即得。

法莫替丁钙镁咀嚼片供试品溶液(1.00 mg/mL)：取本品5片，精密称定，研细，称取细粉适量(约相当于法莫替丁10 mg)至50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀1 min，再以350 r/min振摇40 min，于10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

1.3 色谱条件

色谱柱为ACE EXCEL 3 C18-AR(150 mm × 4.6 mm,3 μm)，流速：0.50 mL/min；柱温：30 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量：5 μL。流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序：0～1.0 min，5%B；1.0～3.0 min，5%～20%B；3.0～7.0 min，20%～100%B；7.0～9.0 min，100%B；9.0～9.1 min，100%～5%B；9.1～14.0 min，5%B。六通阀切换设置：保留时间5.00～7.00 min的流动相进入质谱，其余时间的流动相进入废液。按外标法以峰面积计算供试品中NDMA含量。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，采用正离子平行反应监测(PRM)扫描模式，扫描范围：m/z50～95，扫描m/z：75.055 6，隔离窗口：m/z1.5，碰撞能量(NCE)：30。鞘气流速：55 arb(arbitrary units)，辅助气流速：15 arb，喷雾电压：3.5 kV，离子传输管温度：350 ℃，辅助气加热温度：400 ℃。

图1 NDMA的PRM模式高分辨质谱图Fig.1 High resolution mass spectrum of NDMA in PRM mode

2 结果与讨论

2.1 实验条件的考察

2.1.1 质谱条件的优化《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)》[3]规定NDMA的可接受摄入限度为96 ng/d，而法莫替丁钙镁咀嚼片的最大摄入量为20 mg/d，二者的比值4.80×10-6(即4.8 ppm)即为法莫替丁及法莫替丁钙镁咀嚼片中NDMA的允许限度。根据供试品溶液中法莫替丁的质量浓度为1.00 mg/mL，NDMA的定量下限须低于2.40 ng/mL(即NDMA限度浓度4.8 ng/mL的50%)，对仪器灵敏度性能要求很高。但NDMA是低质量数化合物，其母离子m/z仅为75.055 6，质谱检测时基线噪音较大，影响色谱峰信噪比，导致灵敏度较低。为此，考察了全扫描(Full MS)、目标物选择性离子检测(Targetd SIM)、全扫描-数据依赖的二级扫描(Full MS/dd MS2)、平行反应监测(PRM)等不同的质谱扫描模式，发现PRM模式下NDMA的基线噪音最低、信噪比最高，其信噪比高于其他扫描模式10倍以上。应用XCalibur 4.0软件选择最佳碰撞能量、提取离子，并对离子源气流速、温度、电压进行优化，最终实现了NDMA检测的灵敏度要求。最佳质谱条件如“1.4”所示，NDMA的高分辨质谱图如图1所示。

2.1.2 色谱条件的优化供试品溶液中含有高质量浓度的法莫替丁(1.00 mg/mL)和痕量的NDMA(<100.00 ng/mL)，如果高浓度法莫替丁进入质谱系统，会污染离子源并产生严重的基质效应，影响痕量NDMA的准确测定。因此，应使NDMA和法莫替丁达到足够的色谱分离度，通过六通阀将法莫替丁色谱峰切换到废液，避免高浓度法莫替丁进入质谱。考察了ACE EXCEL 3 C18-AR(100 mm×4.6 mm,3 μm)色谱柱的分离效果，发现NDMA和法莫替丁的色谱分离较差，二者保留时间仅相差1.3 min，对阀切换造成了困难。改用ACE EXCEL 3 C18-AR(150 mm×4.6 mm,3 μm)色谱柱，NDMA的保留时间约为6.15 min，与主成分法莫替丁的保留时间差值增至2.4 min，实现了较好的色谱分离，通过六通阀仅将保留时间5.00～7.00 min的流动相进入质谱，有效避免了高浓度法莫替丁的基质干扰，保护了离子源，使NDMA的测定更加准确可靠。优化的色谱条件如“1.3”所示。

2.1.3 样品预处理方法的优化NDMA易溶于水、醇，但法莫替丁在冰醋酸中易溶，在甲醇中微溶，在水中几乎不溶。本实验分别以冰醋酸和甲醇作为溶剂配制1.00 mg/mL的法莫替丁和5.00 ng/mL NDMA混合溶液，平行测试6次(n=6)。结果显示，冰醋酸中NDMA的平均色谱峰面积仅为在甲醇中峰面积的34.2%。原因可能为暴露在酸中的NDMA在前处理过程中不稳定所致。因此，本实验选用甲醇作为提取溶剂，并控制称样量使主成分法莫替丁的质量浓度为1.00 mg/mL(浓度过高则法莫替丁过饱和)。此外，还考察了振摇时间对NDMA提取的影响，发现振摇20、40、60、90 min时，阴性样品加标溶液中5.00 ng/mL NDMA的色谱峰面积分别为421 078、497 403、518 269、513 247，提取时间为40、60、90 min时的NDMA峰面积无显著差异，故选择振摇时间为40 min。本实验前处理简单，提取效果好。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性将溶剂(甲醇)、处理后的辅料溶液、NDMA对照品溶液、法莫替丁溶液、加标回收溶液分别进样测定，NDMA的出峰时间为6.16 min，相同保留时间处的溶剂及辅料溶液均无干扰峰。辅料溶液、NDMA对照品溶液和加标回收溶液的提取离子色谱图见图2。法莫替丁的保留时间为8.57 min，对NDMA色谱峰无干扰。以上结果表明本方法的专属性良好。

图2 提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatogramsA:excipients；B:NDMA standard solution；C:sample of recovery test

2.2.2 基质效应分别制备低(2.50 ng/mL)、中(5.00 ng/mL)、高(7.50 ng/mL)3个水平的空白基质加标溶液和对照品标准溶液，分别进样测定，计算两种溶液中NDMA响应值的百分比，即为基质效应。结果表明，NDMA在低、中、高3个不同浓度下的基质效应为91.4%～102.7%，表明基质不影响NDMA的质谱测定。

2.2.3 线性范围将“1.2.1”配制的系列浓度对照品溶液进样测定。以所得峰面积为纵坐标(y)，NDMA标准溶液的质量浓度为横坐标(x，ng/mL)，加权重1/x2拟合线性校正曲线，建立回归方程，并计算相关系数(r)。结果表明，NDMA在1.00～100.00 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=98 665x-19 485，相关系数r=0.999 7。

2.2.4 检出限与定量下限精密移取1.00 ng/mL的NDMA标准溶液，以甲醇为溶剂逐级稀释，采用本方法进行测定，按信噪比S/N≥3计算检出限，S/N≥10计算定量下限。结果表明方法的检出限为0.20 ng/mL，定量下限为1.00 ng/mL。

2.2.5 回收率与相对标准偏差考察低、中、高3个浓度的NDMA在法莫替丁及其制剂中的回收率和相对标准偏差(RSD)。取已知未检出NDMA的阴性样品约1次服用量(以法莫替丁计10 mg)，法莫替丁原料药(API)及制剂均精密称取9份(低、中、高水平各3份)，分别精密加入适量的NDMA对照品溶液，后续操作按照“1.2.2”方法处理，进样测定，按外标法计算NDMA含量。由表1可知，3个加标浓度下NDMA在法莫替丁及制剂中的平均回收率为98.5%～108%，RSD为2.3%～6.7%，符合药典规定，表明NDMA的回收率和重复性良好。

表1 NDMA在法莫替丁及其制剂中的回收率及相对标准偏差(n=3)Table 1 Recoveries and RSDs of NDMA in famotidine API and preparations(n=3)

2.2.6 稳定性将2.00 ng/mL的NDMA标准溶液保存于进样瓶中，在自动进样器中按照实验条件放置0、4、8、12、24、48 h后进样测定，记录色谱图和峰面积。结果显示，NDMA峰面积的RSD为6.9%，说明该条件下NDMA在48 h内稳定性良好。

2.2.7 耐用性采用2.00 ng/mL的NDMA标准溶液考察了方法的耐用性。将超高效液相色谱-质谱联用仪的柱温分别调整为27、33 ℃，流动相流速分别调整为0.45、0.55 mL/min时，NDMA的色谱图峰形无变化，保留时间和峰面积发生微小改变，表明测定条件轻微变动不影响NDMA的测定，方法耐用性良好。

2.3 样品测定

将47批法莫替丁及制剂样品按照“1.2.2”方法制备供试品溶液，按照“1.3” 和“1.4”条件进样测定，记录色谱图和峰面积，外标法计算NDMA含量。按照法莫替丁中NDMA的限度要求4.8×10-6(即4.8 ppm)，在1批法莫替丁原料和2批法莫替丁制剂中检出了超限的NDMA，测得其质量浓度为6.77～9.73 ng/mL，含量为6.62×10-6～9.57×10-6(即6.62～9.57 ppm)。阳性样品的测定结果如表2所示。

表2 阳性样品的测定结果Table 2 Determination results of positive samples

3 结 论

本研究建立了法莫替丁中NDMA的UHPLC-Orbitrap HRMS法，进行了方法学验证并将方法用于法莫替丁及其制剂中NDMA的测定。NDMA的线性范围为1.00～100.00 ng/mL，检出限和定量下限分别为0.20 ng/mL和1.00 ng/mL，低、中、高3个加标浓度下的平均回收率为98.5%～108%，RSD为2.3%～6.7%。将该法用于47批供试品中NDMA的测定，在1批法莫替丁原料和2批法莫替丁制剂中检出了超限的NDMA。本方法灵敏度高、专属性好、回收率高、线性范围宽，操作简便、快速，已用于法莫替丁及其制剂中NDMA的检验，填补了该研究技术空白。本研究有助于医药企业进行生产工艺控制，并为药监部门的监管提供有力的技术支持。