陆依琳 赵晴雨 彭学

摘要：氮是植物生长过程中不可或缺的元素，目前人们主要采用化学方法生产氮肥，但是这种方法存在很多缺陷。固氮菌（nitrogen-fixing bacteria）作为一种有机营养型细菌，由于其具有严格好氧的特点，每年都可以固定得到1亿t以上的氮肥，在解决氮素来源问题上显示出了巨大的潜力。旨在以葡萄糖为唯一碳源，以江苏师范大学的校园土壤为研究对象，在Ashby培养基上进行固氮菌的分离。结果表明，从江苏师范大学校园土壤中共分离得到2株固氮菌，分别命名为菌株610、611;根据革兰氏染色和生理生化分析结果，菌株610、611均为革兰氏阴性菌，菌株610生长的最适温度为 35 ℃，最适pH值为7，菌株611生长的最适温度为30 ℃，最适pH值为8。2株菌株的16S rDNA测序结果显示，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚类节杆菌）的相似度为99.49%，菌株611与Pseudomonas fulva（黄褐假单胞菌）的相似度为98.95%。试验结果为今后高效生产固氮菌生物肥料提供了参考。

关键词：固氮菌;分离;鉴定;硝基酚类节杆菌;黄褐假单胞菌

中图分类号：S182

文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）16-0298-04

植物在生长过程中对氮素的需求量极大，因为氮是组成氨基酸的基本元素，而氨基酸则是构成蛋白质的基本单位。氮气（N2）体积约占空气总体积的80%，且氮在空气中主要以游离状态存在，而生物体只能吸收利用化合态氮，因此需要依靠某些微生物体内的固氮酶来固定空气中游离的氮[1]。1972年，巴西的Dobereine在研究禾本科植物根际时发现了具有固氮作用的固氮菌，它能利用体内的固氮酶把空气中植物无法吸收的氮气转化成氨态氮，并将其固定为植物可以直接利用的氮肥，该发现立即吸引了众多科研工作者的目光，他们因此对固氮菌展开了各方面的研究并获得了令人满意的成果[2]。

固氮菌主要有自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌3种类型。目前，人们对固氮菌的研究主要集中在固氮菌形态学、细胞学和生理生化特征等几个方面，有些科学家则致力于研究适合固氮菌生长的营养条件、生长方式等。固氮菌除了具有基本的固氮功能外，还能产生维生素、生长素，进而促进农作物的生长发育，改善农作物质量[3]。Kumar等通过设计许多试验研究固氮菌对谷物的作用，结果表明，固氮菌在多数情况下都能提高谷物的产量[4]。固氮菌肥与化学肥料相比，具有安全环保的生态效益，施用固氮菌肥可以节约大量原料，并在一定程度上避免对环境造成污染[5]。不断加强土壤固氮菌的筛选、改良、驯化等应用研究，对于减少化学肥料的使用量、促进农业的绿色可持续发展、优化土壤质量等具有重大意义。目前，通过基因工程技术将固氮基因转移至植物体内从而使植物能够发挥固氮作用已经成为一项世界性的热点课题。许多国家的科学家都热衷于运用现代生物技术进行固氮菌的固氮机制和转移微生物固氮能力等方面的研究，并取得了不错的成果，展现出用固氮菌进行生物固氮的良好前景[6]。

本试验以从江苏师范大学校园环境中分离纯化得到的固氮菌为研究对象，探究其生理生化特性，以期为后续生产高质量的固氮菌肥提供基本的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用材料为江苏师范大学校园内土壤。

1.2 试剂

KH2PO4（上海生工，纯度≥99.0%），MgSO4·7H2O（上海生工，纯度≥99.0%），NaCl（上海生工，纯度≥99.5%），CaSO4·2H2O（北京寰宇科创生物科技发展有限公司，纯度≥99.0%），CaCO3（上海生工，纯度≥99.0%），葡萄糖（上海生工，纯度≥99.5%），琼脂（上海生工），LB肉汤（上海生工），草酸铵结晶紫（上海生工），番红（上海生工），无水乙醇（上海生工，纯度≥99.7%），碘液（上海生工），95%乙醇（用无水乙醇配制），细菌基因组抽提试剂盒（宝日医生物技术有限公司），琼脂糖（宝日医生物技术有限公司），50×TAE（自配），1×TAE（自配），DNA marker（宝日医生物技术有限公司），DNA loading buffer（宝日医生物技术有限公司），Gold View（宝日医生物技术有限公司），16S rDNA扩增试剂盒（宝日医生物技术有限公司）等。

1.3 菌株分离

以葡萄糖为唯一碳源，在Ashby培养基[7]上分离菌株。首先在液体培养基中进行富集培养，然后经平板涂布、三区划线之后，获得固氮菌的单菌落。将菌液与80%甘油水溶液按1 ∶ 1体积比混合后保存于 -80 ℃ 冰箱中。

1.4 菌种的鉴定

1.4.1 革兰氏染色 对菌株进行革兰氏染色[8]，并在显微镜下观察鉴定。若菌落呈紫色，则为革兰氏阳性菌;若呈红色，则为革兰氏阴性菌。

1.4.2 16S rDNA测定 用试剂盒提取固氮菌的全基因组DNA，并以此为模板进行16S rDNA扩增[9]。

PCR反应体系见表1，混匀后放入PCR仪中进行扩增，PCR程序如下：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循环;72 ℃保温10 min。PCR结束后，取2 μL反应液与 2 μL DNA loading buffer混匀，并以3 μL DNA marker作为对照进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增是否成功。扩增成功后将PCR反应液纯化，然后送到至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 最适温度的筛选

在3 mL LB液体试管中过夜培养固氮菌，转移100 μL菌液于100 mL LB液体培养基中，设3个锥形瓶为1组平行，将各组同时放入转速为180 r/min的摇床中，并设置不同的温度梯度，5 h后测定D600 nm[10]。

1.6 最适pH值的筛选

在3 mL LB液体试管中过夜培养固氮菌，转移100 μL菌液于100 mL具有不同pH值梯度的LB液体培养基中，以3个锥形瓶为1组平行，将各组同时放入转速为180 r/min的摇床中，5 h后测定D600 nm[11]。

1.7 生理生化反应

在3 mL LB液体试管中过夜培养固氮菌。取1套生理生化管，用砂条割开后，在每根生理生化管中均滴入3滴菌液，置于转速为180 r/min的恒温摇床中，24 h后观察各管反应前后的颜色变化。

1.8 数据分析

在最适温度和最适pH值的筛选试验中，先对每组3个平行样取平均值，再根据平均值用Excel作出柱形图。

2 结果与分析

2.1 2株菌株的形态特征

以江苏师范大学的校园土壤为样品，在以葡萄糖为唯一碳源的Ashby培养基上培养并筛选得到2株固氮菌，分别命名为菌株610、菌株611。其中菌株610的菌落形态为圆形、无色透明、边缘整齐、表面光滑、湿润凸起，而菌株611的菌落形态为卵圆形、较小、呈乳白色、表面湿润、边缘较整齐、中间隆起、含有菌丝。如图1、图2所示，经革兰氏染色并在油镜下观察发现，菌株610为短棒状，菌株611为圆球状，两者都呈“8”字形，且呈现红色，进一步证明本研究分离的固氮菌属于革兰氏阴性菌，如图1、图2所示。

2.2 菌株610、611的16S rDNA电泳结果

以提取得到的菌株610、611的全基因组DNA为模板，以27F、1492R为引物，对2株固氮菌的16S rDNA基因进行扩增。由图3可以看出，所得条带大约在 1 500 bp 处，且单一明亮。

2.3 菌株610、611的测序结果及系统进化树的构建

将菌株610、611的16S rDNA PCR反应液纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得对应序列，再将测序结果提交到模式菌株数据库（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中，检索与所测菌株序列相近的已知菌株，并用MEGA 7.0软件绘制系统进化树。由图4可以看出，菌株610与Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚类节杆菌）的相似性最高，相似度为99.49%;菌株611与Pseudomonas fulva（黄褐假单胞菌）最为相似，相似度为98.95%。

2.4 菌株610、611最适生长温度的筛选

温度对菌株生长的影响较大。由图5所示，当温度为15～35 ℃时，随着温度的上升，菌株610的D600 nm也不断升高，到35 ℃时达到最大值;当温度超过35 ℃后，随着温度的继续升高，D600 nm反而开始下降。因此可见，菌株610的最适生长温度是 35 ℃。菌株611在30 ℃时的D600 nm明显高于其他组，因而菌株611的最适生长温度为30 ℃。

2.5 菌株610、611生长最适pH值的筛选

由图6可以看出，菌株610可以在pH值为3～11的条件下生长，且在pH值为7时生长得最好，因此菌株610生长的最适pH值为7; 而菌株611在pH值为8时的D600 nm明显高于其他组，因此菌株611生长的最适pH值为8。

2.6 菌株610、611的部分生理生化特征

用微量生化反应管对固氮菌菌株610、611的部分生理生化特征进行分析，将培养好的菌液注入用砂条割开的生理生化管中培养24 h，观察其颜色变化。由表2可以看出，菌株610仅能利用部分多糖物质，如果糖、蔗糖、D-核糖等，同时能利用一些氨基酸和有机酸，如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、丙二酸盐等。而菌株611能利用大部分多糖物质，如果糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、山梨糖、鼠李糖等，同时能利用赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等氨基酸;此外，菌株611可以利用部分有机酸，如尿素、丙二酸盐等。

3 讨论

关于从土壤中分离固氮菌的報道已经有很多。本试验从江苏师范大学校园土壤中成功分离出2株固氮菌，经鉴定，这2株菌均为革兰氏阴性菌，其中菌株610生长的最适温度为35 ℃，最适pH值为7;菌株611生长的最适温度为30 ℃，最适pH值为8。对2株菌株的16S rDNA测序结果进行分析可知，菌株610与Arthrobacter nitrophenolicus的相似度为99.49%，菌株611与Pseudomonas fulva的相似度为98.95%。固氮菌的研究发展对农、林、牧、环境保护及能源利用等有着十分重大的理论和实际意义，然而目前科研人员进行的生物固氮研究主要集中在共生固氮菌如根瘤菌上，关于其他类型固氮菌的基础研究水平还需提高。

本试验对固氮菌进行了分离与鉴定，仅完成了基础的筛菌试验，若要进一步研究固氮菌，还需对其固氨酶的活性进行检测，确定有无固氮活性及其活性大小[12]。随着生物科学技术的发展，基因工程技术已被广泛应用，科研人员正在研究用基因工程技术将固氮基因转移从而使植物提高固氮效率，同时也在建构新的固氮微生物，开辟新的研究方向，发展前景非常广阔[13]。

参考文献：

[1]韩 斌，孔继君，邹晓明，等. 生物固氮研究现状及展望[J]. 山西农业科学，2009，37（10）：86-89.

[2]Mrkovacki N，Milic V. Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in agricultural application[J]. Annals of Microbiology，2001，51（2）：145-158.

[3]毛晓洁，王新民，赵 英，等. 多功能固氮菌筛选及其在土壤生态修复中的应用[J]. 生物技术通报，2017，33（10）：148-155.

[4]Kumar V，Narula N. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants[J]. Biology and Fertility of Soils，1999，28（3）：301-305.

[5]刘 晨，贾凤安，吕 睿. 我国耕地重金属污染现状及固氮菌在其修复中的作用[J]. 江苏农业科学，2018，46（3）：21-27.

[6]陈今朝，向邓云. 生物固氮的研究与应用[J]. 涪陵师专学报，2000，16（2）：93-96.

[7]赵 斌，何绍江. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2002：254-255.

[8]樊 佳，林文和，郭子玮，等. 固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验[J]. 实验技与管理，2018，35（1）：66-68.

[9]张世清，李庆洋，高建明，等. 24株剑麻根际联合固氮菌的16S rDNA序列分析[J]. 江西农业学报，2011，23（11）：132-134.

[10]王 琦，李文涛，张沛东，等. 鳗草根际固氮菌的分离鉴定及培养条件的筛选[J]. 中国水产科学，2017，24（4）：791-801.

[11]新 楠，樊明寿，王海凤. 羊草和冰草根际高效固氮菌的分离及鉴定[J]. 天津农学院学报，2008，15（2）：40-42.

[12]Chen W H，Zheng D F，Feng N J，et al. The effects of gibberellins and mepiquat chloride on nitrogenase activity in Bradyrhizobium japonicum[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（1）：1723.

[13]张 武，杨 琳，王紫娟. 生物固氮的研究进展及发展趋势[J]. 云南农业大学学报（自然科学），2015，30（5）：810-821.