李晶晶 王思芦 李金娉 刘凯 肖文渊

摘要：为探究小柴胡汤及其拆方对肝细胞损伤的影响，建立四氯化碳（CCl4）致急性肝细胞损伤体外模型;给药后用ELISA试剂盒检测培养基中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）的含量和MTT法检测细胞活率。结果表明，小柴胡汤及其组成成分中黄芩对CCl4损伤的肝细胞保护效果最好，其次是柴胡、党参;小柴胡汤优化试验结果表明，保肝效果2号方剂高浓度组最好。对小柴胡汤及其拆方的抗肝细胞损伤效果进行探讨分析，研究结果表明，2号方剂高浓度组可减缓CCl4致肝细胞损伤，培养基中ALT、AST、MDA水平显著降低，有效减轻了CCl4所致的肝细胞病理损伤，对抗化学性肝细胞损伤具有辅助保护功能。

关键词：中药;四氯化碳（CCl4）;肝损伤;小鼠肝细胞;小柴胡汤

中图分类号：S853.74

文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）16-0217-05

小柴胡汤出自张仲景《伤寒论》，由柴胡45 g、黄芩45 g、党参45 g、半夏30 g、炙甘草15 g、生姜 20 g、大枣60 g组成[1]，是人医临床上用于治疗肝硬化、肝纤维化、肝癌等肝病的经典名方。现代研究表明，小柴胡汤通过抵御肝功能减弱和四氯化碳（CCl4）、乙醇诱导的肠-肝-脑损伤和炎症，降低了四氯化碳、乙醇诱发小鼠肝癌时的死亡率和肝癌发生率[2]。孙兰等研究表明，中药小柴胡汤对小鼠硫代乙酰胺、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加均有一定的抑制作用[3];加味小柴胡汤对小鼠肝损伤有明显的保护作用，是通过显著地降酶、抗氧化、抑制脂质过氧化及调节体内免疫功能发挥其抗肝损伤作用[4]。在兽医临床上多种致病因子容易引起肝细胞损伤，如肝炎病毒、细菌、寄生虫和工业污染中的CCl4等都可直接或间接造成肝小叶坏死，严重的可引起肝功能衰竭、营养失衡等。肝损伤直接影响动物的消化功能，可导致动物消化不良、食欲减退、脂类代谢障碍等，更容易继发其他疾病，如脂肪肝、感染性疾病、肝硬化、肝坏死、肝癌等，直接造成畜禽养殖户的经济损失[5]。小柴胡汤是人医临床治疗多种肝脏疾病的经典名方，现为将其开发成兽医临床上抗肝损伤有效、低成本的中兽药，对其进行拆方。首先在7味中药中找到保肝药效较好的几味药材，再重新组合，并对其抗急性体外肝细胞损伤效果进行分析探讨，旨在为该方剂在兽医临床上应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

柴胡（CH）、黄芩（HQ）、党参（DS）、半夏（BX）、甘草（GC）、生姜（SJ）、大枣（DZ）（购自西昌市长安大药房）;小鼠肝细胞（NCTC 1469）、RPMI-1640培养基、胰酶、PBS、胎牛血清、青链霉素混合液（购自武汉普诺赛生命科技有限公司）;四甲基噻唑蓝（MTT）（购自上海碧云天生物技术有限公司）;二甲基亚砜（DMSO）、四氯化碳、生理盐水（购自成都市科龙化工试剂厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠肝细胞株（NCTC 1469）的培养 将冷冻保存的NCTC 1469复苏后，以1640完全培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液）培养于细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2条件下培养，隔天换液。当细胞长至单层，以PBS洗3遍，再用1 mL 0.25%胰酶消化1.5 min，吹打成单个细胞悬液后计数并调节数量为1.5×105个/mL。在96孔细胞培养板的每孔中加细胞悬液100 μL，48孔细胞培养板的每孔中加细胞悬液500 μL，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后用于以下试验。

1.2.2 CCl4致肝细胞损伤体外模型的建立

1.2.2.1 CCl4誘导肝细胞损伤单因素试验 CCl4和DMSO用0.45 μm针式过滤器过滤后等比例混合，取混合物以培养基10倍稀释至第3管，从第4管以2倍稀释至第6管，得到6个不同CCl4终浓度，分别为160.0、16.0、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL，按“1.2.1”节方法进行细胞培养，经48 h长至85% 96孔细胞培养板旧培养基弃去，将含以上6个不同浓度的含CCl4培养基每孔100 μL加入培养板，每个浓度6个重复，另设6个孔只加完全培养基作空白组，培养24 h后，检测细胞活率，即每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液继续培养4 h后，弃去培养基，每孔加200 μL DMSO在微量振荡器上振荡 15 min，用酶标仪测490 nm处的吸光度代表细胞活率，D490 nm值越大，细胞活率越高。

1.2.2.2 DMSO对肝细胞使用剂量的安全检测 DMSO采用0.45 μm针式过滤器过滤，用培养基将DMSO配成0.10%、0.08%、0.06%、0.04%共4个浓度。将培养48 h长至85% 96孔细胞培养板旧培养基弃去，混匀含DMSO的培养基并迅速加液，每孔100 μL，每个浓度6个重复，另设6个孔加完全培养基作空白组，培养24 h后检测细胞活率。

1.2.2.3 CCl4引起肝细胞损伤的2因子4水平正交试验 该试验是为了筛选出CCl4诱导肝细胞损伤的最佳作用浓度和作用时间组合。CCl4和DMSO等体积混合后用0.45 μm针式过滤器过滤，用培养基将CCl4配成1.6 mg/mL（0.10%）、1.3 mg/mL（0.08%）、0.9 mg/mL（0.06%）、0.6 mg/mL（0.04%）共4个浓度。将培养48 h长至85%的96孔细胞培养板旧培养基弃去，用混匀含CCl4的培养基迅速加液，每孔100 μL，每个浓度6个重复，6个孔加完全培养基作空白组，放培养箱培养6组为建模成功，且可减少CCl4的用量以及培养时间。培养6、12、18、24 h后检测细胞活率。

并用SPSS 21.0软件进行分析得出CCl4浓度与作用时间的最佳组合，以该组合制备细胞模型的细胞活率显著低于空白对照。

1.2.3 小柴胡汤及其拆方对体外CCl4致肝细胞损伤的影响

1.2.3.1 8种水煎剂的制备 采用常规煎煮法[2]分别制备小柴胡汤全方及其各味药材的共8种水煎剂，以g（生药质量）/mL表示各水煎剂母液的浓度。

1.2.3.2 8种水煎剂对肝细胞最大安全浓度测定 将8种水煎剂以0.45 μm滤膜过滤后，采用细胞培养液将各中药的水煎液通过2倍稀释成6个不同浓度。取8个96孔板，分别用于检测8种水煎剂的以上浓度对肝细胞活率的影响。各培养板按“1.3.1”节的方法分别接种等量细胞，培养48 h后，弃去旧培养基，每个板加入一种水煎剂，每个浓度6次重复，每个孔加100 μL含药培养基;每个细胞培养板设6个孔加100 μL纯培养基为空白组。常规培养24 h后，按“1.2.2.1”节检测细胞活率。

1.2.3.3 8种水煎剂对体外CCl4致肝细胞损伤的影响 以正交试验筛选出的CCl4浓度及作用时间制备出体外肝细胞损伤模型，将“1.2.3.2”节筛出的各最大安全浓度的水煎剂以含CCl4的培养基2倍稀释至第7管，得到7个供试浓度。取8个培养板，分别检测8个水煎剂的不同浓度对体外CCl4致肝损伤的影响，每个浓度设6个重复，同时设有空白组和模型组。按“1.2.2.1”节检测细胞活率。

1.2.4 优化小柴胡汤对体外CCl4致肝细胞损伤的保护作用 将“1.2.3.3”节筛选出的最佳有效浓度的小柴胡汤水煎剂设为1号供试液;将“1.2.3.3”节筛选出与模型组比有显著差异的单味中药按原方比例混合药材后，按“1.2.3.1”节制备水煎剂设为2号供试液;将“1.2.3.3”节中各单味药的最佳有效浓度等比例混合后设为3号供试液。各供试液用含与“1.2.3.3”节相同浓度的含CCl4培养基2倍稀释成高中低3个浓度。取1个48孔细胞培养板，接种细胞培养48 h后，弃去原培养基，设空白组、模型组、3个供试液不同浓度共11个组，每个组4个重复，其中空白组加500 μL培养基，模型组加 500 μL 含CCl4的培养基，其余各组分别加入不同浓度供试液的含CCl4培养基。按“1.2.2.1”节方法检测细胞活率，并收集培养液，用ELISA试剂盒检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙二醛（MDA）含量的变化。

1.2.5 数据处理与分析 采用SPSS 21.0软件对结果进行统计分析，所有数据采用“均数±标准差”表示，各组数据间进行方差多重比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CCl4诱导肝细胞损伤单因素试验

由表1可知，160.0 mg/mL CCl4组、16.0 mg/L CCl4组的细胞活率显著低于空白组（P<0.05），表明160.0～16.0 mg/mL CCl4会对肝细胞造成明显的损伤;1.6 mg/mL CCl4组细胞活率与空白组和 16.0 mg/mL CCl4组细胞活率均无显著性差异，为“1.2.2.3”节试验使用的CCl4浓度提供参考。

2.2 DMSO对肝细胞使用剂量的安全检测

由表2可知，与空白组相比，各试验组不同浓度的DMSO对肝细胞活率的影响均无显著性差异，表明DMSO的使用浓度对肝细胞无损伤作用，只有助溶效果，为试验“1.2.2.3”节提供参考。

2.3 正交试验结果

由表3至表5可知，由Ⅲ型平方和比较可知，影响因素中CCl4浓度和培养时间对体外CCl4致肝细胞损伤模型都具有显著性影响，2个因素的主次关系是CCl4浓度>培养时间，最佳组合应为A2B4。试验组D490 nm显著低于空白组，表明肝细胞体外损伤模型建模成功。经过正交试验优化的肝细胞损伤模型中CCl4浓度为1.3 mg/mL，培养时间为24 h。

2.4 小柴胡汤及其拆方后8种水煎剂对肝细胞的最大安全浓度

由表6可知，组成小柴胡汤的7味药材中，安全浓度最大的是半夏（BX），安全浓度最小的是黄芩（HQ）。

2.5 8种水煎剂对CCl4致肝细胞损伤的影响

由表7可知，空白组细胞活性显著高于模型组细胞活性，表明体外肝细胞损伤模型建立成功。CH组、HQ组的细胞活性显著高于模型组细胞活性;XCHT组、DS组、GC组、BX组的细胞活性极显著高于模型组，结果表明黄芩保肝效果最好，与模型组相比较细胞活率提高54.5%，其次是柴胡、党参;除了生姜和党参，其余各水煎剂对损伤的肝细胞有保护作用。

2.6 优化小柴胡汤对体外CCl4诱导肝细胞损伤的保护作用

由表8可知，空白组细胞活性与模型组差异显著，表明体外肝损伤模型建立成功。模型组肝细胞活性显著低于1号方剂高浓度组、2号方剂高浓度组、3号方剂高、中浓度组，表明以上4组供试药物及浓度对CCl4引起肝细胞损伤有显著的抑制作用，且2号方剂高浓度组对肝细胞保护效果最好。

由表9可知，模型组比空白组MDA含量升高303.6%（P<0.01），AST含量升高68.9%（P<0.01），ALT含量升高57.3%（P<0.05）;1號方剂高浓度组与模型组比MDA含量降低70.4%（P<0.01）、AST含量降低38.3%（P<0.01）、ALT含量降低33.6%（P<0.05）;2号方剂高浓度组与模型组相比MDA含量降低73.0%（P<0.01）、AST含量降低39.4%（P<0.01）、ALT含量降低55.7%（P<0.05），说明2号方剂在该浓度时也有效抑制了CCl4对肝细胞的损伤;3号方剂高浓度组与模型组相比MDA含量降低71.3%（P<0.01）、AST含量降低37.1%（P<0.01）、ALT含量降低39.3%（P<0.05）;3号方剂中浓度组与模型组相比MDA含量降低了68.4%（P<0.01）、AST含量降低26.8%（P<0.01）、ALT含量降低了25.8%（P<0.05）。结果表明，体外肝细胞损伤模型建立成功，保肝效果2号方剂高浓度组>1号方剂高浓度组>3号方剂高浓度组>3号方剂中浓度组。

3 讨论

肝脏疾病是常见病和多发病，有着发病率高、治疗难度大、易恶化的特点，是近年来全世界临床治疗的重点和难点。多数肝疾病共有的病变结果是肝细胞的损伤，长期的肝损伤会导致脂肪肝、肝硬化、肝纤维化甚至肝癌[6-7]，所以肝病严重威胁人们的身体健康且造成直接经济损失。CCl4致肝损伤经典模型常用于快速评价和筛选保肝药物[8]，当CCl4损害肝细胞时不但会增加细胞膜通透性同时改变细胞膜代谢、功能和结构，对机体造成进一步损害[9-10]。当肝细胞膜通透性升高，使得ALT和AST大量渗入细胞外液，使得培养基中ALT和AST含量突然大量升高[11-12]。ALT与AST是诊断肝脏疾病最常用的酶，其中ALT被世界卫生组织（WHO）推荐为最敏感的肝功能检测指标之一[13]。MDA在体内自然生成，是氧化应激的标志物，可对细胞进一步产生破坏作用。体内抗氧化系统能力的降低是脂质过氧化产生的前提，过氧化肝损伤时肝组织MDA含量增高，MDA含量不仅反映了肝细胞生物膜脂质过氧化的程度，还反映了肝脏疾病的严重程度，因此可作为评价反映脂质过氧化的程度和肝损伤程度的指标[14-15]。

本試验首次对小柴胡汤及其拆方的抗肝细胞损伤效果进行探讨分析，采用1.3 mg/mL CCl4培养小鼠肝细胞24 h建立体外肝损模型，通过测定中药水提物24 h后培养基中ALT、AST、MDA的含量，评价不同浓度的小柴胡汤及其拆方对体外CCl2致肝细胞损伤的保护作用。结果表明，2号方剂高浓度组（4.2 μg/mL）与其拆方中黄芩（0.2 μg/mL）、柴胡（5.0 μg/mL）水提物可减轻CCl4致肝细胞损伤，培养基中ALT、AST、MDA水平显著或极显著降低，有效减轻化学性毒物所致的肝细胞病理性损伤，对抗化学性肝损伤具有辅助保护功能，其机制可能与中药提取物抑制转氨酶、稳定细胞膜的结构、抗氧化及清除自由基等作用有关。本试验用8 mmol/mL CCl4损伤小鼠肝细胞建立体外肝损模型，在检测CCl4毒性试验时，由于CCl4不溶于培养基，采用等体积的DMSO助溶，检测后设定可正交试验需要CCl4的浓度，所以DMSO的毒性试验只需要检测需要DMSO浓度的毒性，其结果表明实验组与对照组差异不显著，正交试验细胞的损伤均由CCl4造成。通过测定给药24 h后培养基中ALT、AST、MDA的含量，评价不同浓度的小柴胡汤与其拆方对体外CCl4致肝损伤的保护作用。在建模过程使用更少的DMSO助溶，减少了化学药物的使用，既节约了能源又减轻了环境的负担，培养24 h能有效缩短培养时间并能达到相同的试验目的。小柴胡汤与其拆方水提物可减轻CCl4致肝损伤，培养基中ALT、AST、MDA水平显著降低，有效减轻了化学性毒物所致的肝组织病理损伤，对化学性肝损伤具有辅助保护功能，其作用机制与抑制转氨酶稳定细胞膜的结构、抗氧化、清除自由基等作用有关。

参考文献：

[1]刘钟杰，许剑琴. 中兽医学[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2002：209.

[2]胡小剑，刘晓秋. 小柴胡汤对四氯化碳/乙醇诱发小鼠肝癌肠-肝-脑损伤的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（23）：207-212.

[3]孙 兰，朱晓洪，李庆勇. 中药配方颗粒制备小柴胡汤的药效研究[J]. 中药药理与临床，2004，20（2）：4-5.

[4]谢 斌. 加味小柴胡汤抗实验性肝损伤及肝细胞凋亡作用的研究[D]. 广州：广州中医药大学，2006.

[5]贺菊萍，潘迎捷，赵 勇. 牛蒡提取物对四氯化碳诱导肝损伤小鼠的保护作用[J]. 现代食品科技，2014，30（11）：6-11.

[6]李 静，韩俊洋，张 露，等. 新疆奎屯地区砷暴露致肝损伤现况调查[J]. 新疆医科大学学报，2015，38（2）：231-234.

[7]李小丽，王楷扬，胡建辉，等. 葡萄籽原花青素对CCl4诱导小鼠氧化性肝损伤的保护作用及其机制研究[J]. 中国药房，2016，27（13）：1752-1755.

[8]Abbas A T，El-Shitany N A，Shaala L A，et al. Red Sea suberea mollis sponge extract protects against CCl4-induced acute liver injury inratsvia an antioxi dant mechanism[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine，2014，67（23）：745-606.

[9]吕 宁，单万水，黄慧谦. 检测丙氨酸转氨酶及天门冬氨酸转氨酶在病毒性肝炎中的临床意义[J]. 中国现代药物应用，2009，3（24）：73-74.

[10]徐 博，沈 楠，安 英，等. 汉防己多糖对急性酒精性肝损伤小鼠氧化应激及肝细胞凋亡的影响[J]. 中国药房，2017，28（7）：885-888.

[11]Dai H J，Li D W，Wang Y X，et al. Induction of heat shock protein 27 by bicyclol attenuates d-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury[J]. Eur J Pharmaco，2016，791（1）：482-490.

[12]Ye N H，Liu S T，Lin Y Y，et al. Protective effects of intraperitoneal injection of TAT-SOD against focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Life Sciences，2011，89（23）：868-874.

[13]王 宫，王 瑾，陈耀金. 沉水樟芝对大鼠四氯化碳所致急性肝损伤的保护作用[J]. 海峡药学，2018，30（4）：29-31.

[14]林久茂，王瑞国. 卷柏对试验性肝损伤小鼠保护作用的试验研究[J]. 福建中医学院学报，2006，16（2）：28-30.

[15]陈红艳，严 莉，王建华，等. 甘草提取物对小鼠四氯化碳急性肝损伤的影响[J]. 中国中医药信息杂志，2009，16（7）：24-25.