赵园园 孟金柱

摘要：表皮内干细胞因子（stem cell factor，简称SCF）是由角化细胞合成并分泌到细胞间隙，参与黑色素细胞存活、增殖和黑色素生成。为确定黑色素细胞能否合成SCF，分离培养绵羊的皮肤黑色素细胞，并运用免疫荧光技术对黑色素细胞内SCF进行检测，结果显示，分离培养的黑色素细胞特征明显，且在黑色素细胞中检测到存在SCF蛋白。据此可以推测黑色素细胞也能合成SCF，它在黑色素细胞存活、增殖和黑色素生成中发挥重要作用。

关键词：绵羊;黑色素;形态特征;干细胞因子（SCF）;表达定位

中图分类号：S826.1

文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）16-0079-03

干细胞因子（stem cell factor，简称SCF）又被称为肥大细胞因子或c-kit配体，是一种膜锚定的非共价结合二聚体，通过与c-kit受体结合进行信号转导，是造血干细胞、生殖细胞、黑色素细胞和肥大细胞迁移、存活和增殖所必需的[1]。SCF mRNA通过选择性剪接形成2个不同的跨膜前体，可对细胞表面蛋白酶的敏感性进行区分。较大的剪接变异体（SCF-M1）包含1个蛋白水解位点，可迅速产生可溶性SCF蛋白（S-SCF），而较小的剪接变异体（SCF-M2）缺乏这个蛋白水解位点，可形成膜结合形式SCF蛋白（M-SCF）。然而，较小的剪接变异体的替代水解位点也会被加工，但效率很低。S-SCF调控黑色素前体细胞的迁移，相对地，M-SCF向表皮的黑色素细胞传递导向、存活和增殖信号[2]。

先前的研究表明，表皮SCF是由角化细胞衍生形成的，通过与黑色素细胞膜上的c-kit结合影响黑色素细胞的存活、迁移和增殖以及黑色素合成[3]。为明确SCF在黑色素细胞中的表达部位，本研究分离培养绵羊黑色素细胞，并用免疫荧光对绵羊皮肤黑色素细胞中的SCF蛋白的表达进行定位研究，以期为进一步研究其在黑色素细胞存活、增殖及色素生成中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验以1岁龄黑白花绵羊为研究对象，用取皮器取黑色皮肤（直径约1 mm）进行黑色素细胞的分离。

1.2 皮肤黑色素细胞的分离培养

在超净工作台中，将绵羊皮肤放入75%酒精中浸泡约10 min，用含双抗（青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗3～5次，将皮肤组织剪成2 mm×2 mm的小块，真皮朝下放入无菌培养皿中，加入0.05% Dispase Ⅱ酶 10 mL，4 ℃下消化16 h，采用眼科镊分离开真皮和表皮，将表皮放入0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，室温下孵育5 min，随后加入等体积含10% FBS的培养基终止消化，转入细胞培养箱中（含5% CO2）孵育1 h，反复吹打，形成黑色素细胞悬液，采用200目细胞筛进行过滤，收集过滤液，低速冷冻离心（1 000 r/min，4 ℃），弃上清，加入 2 mL 含双抗和生长因子的MELM（ScienCell）培养基，然后进行细胞计数，调整细胞浓度至5×104個/mL，转移至六孔细胞培养板中，每孔加入 1 mL 细胞悬液，再加入等体积的细胞培养基，置于CO2细胞培养箱中，37 ℃培养 48 h，更换培养基，继续培养，待细胞生长至约80%进行传代培养。细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶进行消化。

1.3 免疫荧光

对浓度达到约80%的细胞进行传代培养，将其转移至铺有盖玻片的细胞培养板中，待细胞生长至浓度约为80%时，去掉培养基，用PBS洗3次。取出附着有细胞的盖玻片，注意不要触碰到细胞，加入4%多聚甲醛冰上固定 15 min，用PBS洗3次，每次3 min，往载玻片上滴加0.5% Triton X-100，以覆盖全部细胞为宜，室温孵育20 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加山羊血清，室温封闭30 min，用PBS洗3次，滴加SCF抗体（一抗，ab64677，abcam，1 ∶ 200 稀释）稀释液，以滴加PBS为对照组，放入温盒中，4 ℃过夜孵育第2天取出，在室温下复温 30 min，用PBST（PBS溶液加Tween-20）洗3次，每次3 min，滴加链霉素和素-生物素-过氧化物酶复合物-异硫氰酸荧光素（SABC-FITC）（山羊IgG）（荧光二抗，1 ∶ 100，博士德）37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，吸干水，用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜蓝光激发荧光下观察、采集图像。

2 结果与分析

2.1 绵羊皮肤黑色素细胞的形态特征观察

对分离培养的第3代绵羊黑色素细胞进行形态学观察，结果（图1）发现，绵羊黑色素细胞生长较快，排列紧密，呈鹅卵石状排列，细胞有突起，突起数量为1～3个，细胞排列密集时，突起较少，而分布稀疏部位的细胞突起较多且明显。

2.2 绵羊皮肤黑色素细胞中SCF的表达定位

通过免疫荧光技术对绵羊皮肤黑色素细胞中的SCF蛋白进行检测，由图2可知，SCF蛋白可在绵羊黑色素细胞中表达，主要分布在细胞质中，尤其是细胞核的周围。

3 讨论

对黑色素细胞的分离多采用酶消化法，主要有Dispase Ⅱ酶联合胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶独立消化法，因胰蛋白酶对细胞的损伤作用较明显，本

研究采用Dispase Ⅱ酶联合胰蛋白酶消化法来分离绵羊皮肤的黑色素细胞。白瑞等发现，Dispase Ⅱ酶处理组收集的黑素细胞明显多于其他组，说明Dispase Ⅱ酶能更好地分离皮肤，并且能更完全地摧毁皮肤的基底层，使黑色素细胞更完全地暴露出来，便于收集到更多的黑色素细胞，同时，由于胰蛋白酶的处理时间缩短，大大降低了对细胞的损伤，使细胞活性和生长状态更好[4]。牛牧采用酶消化法联合组织块法对人的皮肤黑色素细胞进行分离，发现原代细胞的数量虽然稍少，但细胞树突较多、交织成网、贴壁良好[5]。本研究获得的黑色素细胞形态、结构与先前的研究[6-7]相符合。

SCF/c-kit信号通路在黑色素细胞中能诱导小眼畸形相关转录因子（MITF）和酪氨酸相关蛋白酶1（TYRP1）的转录，TYRP1是酪氨酸酶（TYR）家族成员之一，该家族能直接催化黑色素的生成，而MITF通过与该基因家族的启动子结合促进其表达，从而促进黑色素合成[8-11]。本研究结果显示，SCF在黑色素细胞中存在，这为研究SCF在黑色素细胞中的功能提供了新方向。另外，SCF在细胞核周围区域分布丰富，这可能是由于基因在细胞核内转录，细胞质中翻译成蛋白质。

4 结论

本研究成功分离培养绵羊黑色素细胞，观察发现，细胞特征明显。SCF可在黑色素细胞中表达，且集中表达区域为细胞核的周围。

参考文献：

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