韩 冰， 丁 雷， 史 沐， 周建民， 袁明珠， 任 颖， 李 爽， 崔长征

华东理工大学资源与环境工程学院， 高浓度难生物降解有机废水处理技术国家工程实验室， 上海 200237

反硝化细菌主要通过诱导产生硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶，来实现水体中NO3--N的去除[4-5]. 酶的活性易受温度、pH等环境因子的影响[6]，而实际废水处理系统为一开放系统，环境条件复杂且不稳定，因此脱氮细菌应具有较宽泛的环境条件适用范围. 目前已分离获得的大多数反硝化细菌脱氮进程需在温度为20～35 ℃、pH为6.5～7.5的条件下进行，适用环境条件较为严苛. 菌株Pseudomonassp. y3[7]在pH为8.5的环境中，反硝化作用被严重抑制，脱氮率不足20%. ZHANG等[8]研究发现，当pH大于8时不利于反硝化菌株BacillusmethylotrophicusL7生长，脱氮效果不理想. LI等[9]分离得到的反硝化菌株PseudomonasstutzeriYG-24仅在25～35 ℃具有较好地脱氮效果，当温度升至40 ℃时，NO3--N的去除率降至2.24%. 目前，已分离获得的大多数反硝化细菌脱氮速率较低. HUANG等[10]筛选得到的芽孢杆菌Bacillussp. N31，在初始ρ(TN)为20 mg/L下，经过48 h的培养，亚硝酸盐和硝酸盐的去除率分别为89.3%和89.4%，而最大脱氮速率仅分别为0.73和0.59 mg/(L·h). 因此，分离获得具有较高脱氮能力和较宽适用环境条件的反硝化细菌，以强化生物脱氮工艺效能，降低氮素污染，应对日趋严苛的废水TN排放标准，具有重要的理论研究意义和实际工程应用价值.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1菌株来源

菌株分离自某煤化工废水处理厂反硝化缺氧池活性污泥.

1.1.2培养基

向BTB培养基和LB培养基中分别添加1.6%(W/V)的琼脂，以制备相应的固体培养基. 所有培养基均经121 ℃灭菌20 min.

1.2 菌株分离与鉴定试验方案

1.2.1菌株分离与初筛

将从某煤化工废水处理厂反硝化缺氧池中取得的活性污泥沉淀后制成污泥悬液，取5 mL置于装有200 mL反硝化培养基的250 mL锥形瓶中，加入5 mL灭菌后的液体石蜡，于30 ℃恒温培养箱中静置培养. 待反硝化培养基表面产生大量气泡后取部分菌液离心、洗涤后转移到新的反硝化培养基中. 经多次富集后，取100 μL菌液系列稀释，分别取稀释了104、105、106和107倍的菌液100 μL，均匀涂布到BTB平板上；再将BTB平板倒置于厌氧罐中，于30 ℃培养箱中静置培养；经反复分离纯化后挑取蓝色单菌落，进行硝酸盐还原产气试验，并加入二苯胺和格里斯显色试剂，挑选出产气多、产气快、反硝化彻底的菌株接种到斜面培养基上保存以备用.

1.2.2菌株复筛

根据硝酸盐还原产气及显色试验得到初筛菌，利用LB培养基活化，离心后采用0.8%的无菌生理盐水洗涤重悬至OD600(菌液在600 nm波长时的吸光度)为1，以10%的接种量转入装有100 mL反硝化培养基的150 mL锥形瓶中，置于30 ℃、80 r/min的摇床中培养，试验设置空白对照. 培养3 d后取样，经离心(5 min，4 ℃，12 000 r/min)、0.22 μm的滤膜过滤后，测定各菌液的ρ(NO3--N)和ρ(NO2--N)，每株菌设置3个平行样.

1.2.3形态学特征观察

将分离纯化后的菌株HK13于LB平板上划线，待长出单个菌落后进行形态观察；同时，对菌株进行革兰氏染色. 菌体形态采用S-3400N型扫描电子显微镜观察、鉴定.

1.2.416S rRNA序列测定和同源性比较

菌体DNA参照Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit的方法进行提取. 采用细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增. PCR反应体系(25 μL)：Taqbuffer 2.5 μL、MgCl22.0 μL、dNTPs 0.5 μL、上游引物和下游引物均1.0 μL、超纯水16.5 μL、离心混匀后加入Taq酶0.5 μL、模板1.0 μL. PCR反应条件：①95 ℃预变性4 min；②94 ℃变性20 s；③58 ℃退火20 s；④72 ℃延伸1 min；⑤72 ℃，7 min；②～④步骤循环35次. PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电脉检测，回收特异条带后进行基因序列测定.

将获得的细菌16S rRNA基因序列(MN294682)提交到NCBI，利用Blast进行同源性比较. 利用MEGA 7.0软件进行多序列比对分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树.

1.3 影响因子研究试验方案

将菌株HK13接种于装有200 mL反硝化培养基的250 mL三角瓶中，研究碳源类型(乙酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、蛋白胨和淀粉)、C/N(2、4、6、8、10和12)、初始pH(5、6、7、8、9、10和11)、溶解氧(以不同摇床转速表征不同浓度的溶解氧，摇床转速分别为0、50、100、150和200 r/min)和培养温度(15、20、25、30、35、40、45和50 ℃)对菌株HK13反硝化特性的影响. 除上述单因子影响试验外，控制培养温度为30 ℃，C/N为8，pH为7，摇床转速为100 r/min，并取已探究因子的最优条件进行其他单因子条件的研究. 定期取样测定菌液的OD600值. 经高速离心(5 min，4 ℃，12 000 r/min)、0.22 μm滤膜过滤后，测定滤液中ρ(NO3--N)和ρ(NO2--N). 试验均设置空白对照和2个平行样，试验重复3次.

1.4 分析方法

ρ(TN)采用过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；ρ(NO3--N)采用紫外分光光度法测定；ρ(NO2--N)采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定. 脱氮率按照式(1)(2)计算：

η=(c0-ct)c0×100%

(1)

V=(c0-ct)t

(2)

式中：η为氮的去除率，%；c0为初始氮浓度，mg/L；ct为t时刻氮浓度，mg/L；V为氮的去除速率，mg/(L·h)；t为时间，h. 此外，定义ρ(NOx--N)为ρ(NO3--N)与ρ(NO2--N)之和.

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离与鉴定

2.1.1菌株筛选

通过硝酸盐还原产气及显色试验初筛共得到15株反硝化菌株，将其接种至初始ρ(NO3--N)为280.96 mg/L〔ρ(KNO3)为 2 000 mg/L〕的反硝化培养基中，培养3 d后，各菌株的脱氮效果如图1所示. 由图1可见，6号和13号菌株对NOx--N的去除率均在95%以上，将两株菌分别接种于初始ρ(NO3--N)为143.84 mg/L的试管反硝化培养基中，培养36 h后，13号菌的脱氮率达96.66%，而6号菌株由于存在NO2--N积累〔ρ(NO2--N)为23.34 mg/L〕，对NOx--N的去除率仅为80.50%. 综合比较13号菌株的脱氮效果要优于6号菌株，将13号菌株命名为HK13.

图1 15株反硝化细菌的脱氮效果Fig.1 The nitrogen removal effects of 15 strain denitrifiers

2.1.2菌株HK13鉴定

将菌株HK13划线于LB平板上，培养2 d后，菌落形貌如下：圆形、浅黄色、中凸、表面磨砂. 油镜下观察菌株HK13为短棒状，革兰氏染色阴性. 菌株HK13的SEM结果如图2所示，菌株呈直棒状，大小为(0.6～0.9)μm ×(1.5～3.5)μm，无鞭毛和芽孢. 经16S rRNA基因测序从菌株HK13中获得长度为 1 379 bp的碱基序列，系统发育树如图3所示，该菌与多株施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)的同源性在99%以上，鉴定为施氏假单胞菌属(Pseudomonasstutzeri).

2.2 菌株HK13反硝化特性影响因子

图2 菌株HK13扫描电镜图(×10 000)Fig.2 Scanning electron microscopy image of strain HK13 (×10 000)

图3 基于16S rRNA序列同源性构建的菌株HK13系统发育树Fig.3 Phylogenetic trees of strain HK13 based on the partial 16S rRNA sequences

2.2.1碳源

碳源在微生物代谢中，同化用于微生物增殖，异化用于提供电子和能量. 不同的碳源在代谢中的地位不同，不同菌株对各种碳源的利用率也不同[11]. 表1为菌株HK13在不同碳源下培养3 d后的生长情况和脱氮效果. 由表1可见，碳源类型对菌株HK13脱氮效果的影响较大. 在初始ρ(NO3--N)为277 mg/L 下，以柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠为碳源，培养3 d后ρ(NO3--N)分别降至2.01、6.36和4.43 mg/L，且无亚硝酸盐积累，菌株HK13的脱氮率分别为99.27%、97.72%和98.34%. 而当以蛋白胨和淀粉为碳源时，产生了大量的亚硝酸盐积累，ρ(NO2--N)分别达112.65和220.32 mg/L，脱氮率分别为36.18%和9.85%. 可见，菌株HK13对柠檬酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠的利用情况较好，其中最适碳源为柠檬酸钠，这与菌株Pseudomonassp. GL19[12]和Pseudomonassp. B[13]以柠檬酸钠为碳源时具有最佳脱氮效果的结论相似.

表1 碳源种类对菌株HK13反硝化脱氮能力的影响

2.2.2C/N

在反硝化脱氮过程中，碳源更重要的作用是为氧化态氮还原反应提供电子. 低C/N将导致反硝化过程中亚硝酸盐大量积累，从而抑制反硝化细菌的生长和脱氮进程[14]. 而C/N过大，将会增大废水处理成本. 图4为菌株HK13在不同C/N下的生长情况和脱氮效果. 由图4可见，C/N对菌株HK13反硝化脱氮效果影响较大. 目前已获得的多数反硝化菌的最佳C/N均大于10. YANG等[15]分离得到的AcinetobacterjuniiYB最佳C/N为15；CHEN等[16]发现，Acinetobactersp. T1在C/N为10下脱氮效果最好. 而该研究获得的菌株HK13在C/N为8下脱氮效果最佳，24 h内可将ρ(NO3--N)由107.63 mg/L降至1.00 mg/L，且最终无亚硝酸盐积累，平均脱氮速率为4.44 mg/(L·h)，远远高于HUANG等[10]获得的芽孢杆菌Bacillussp. N31的脱氮速率. 当C/N增至10和12时，脱氮率没有明显的提高，甚至有轻微的下降，这与路俊玲等[17]的研究结果相似，可能是因为此时碳源不再是限制条件. 当C/N为2时，由于碳源严重不足，NO3--N还原成NO2--N受到严重抑制，NO3--N的去除率仅为28%. 而当C/N为4和6时，NO3--N的去除率均在90%以上，但由于亚硝酸盐的大量积累导致NOx--N的去除率不高.

2.2.3pH

pH不仅可以影响微生物的酶活性，还会引起微生物细胞膜荷电的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收能力[18]. 图5为菌株HK13在不同pH下的生长情况和脱氮效果. 由图5可见，菌株HK13适宜生长的pH范围为7～10. 当pH为5时，菌体不能生长；pH为6时，NO3--N的去除率在90%以上，但亚硝酸盐还原酶活性被抑制，导致大量亚硝酸积累；pH为7～10时，菌株HK13快速生长，脱氮效果显著，24 h时NOx--N的去除率均在97%以上. 特别指出的是，当pH为10时，菌株HK13在16 h即可将ρ(NO3--N)由105.84 mg/L降至1.20 mg/L，且无亚硝酸盐积累，平均脱氮速率为6.54 mg/(L·h)，表明该菌具有嗜碱特性. 而目前已获得的大多数反硝化菌适宜生长的pH均为中性或弱碱性. 牛萌等[19]发现，当pH为10时，短程反硝化污泥的活性会被严重抑制. 白洁等[20]从胶州湾沉积物中分离得到的反硝化细菌Zobellellasp. B307，在初始pH为10下，NO3--N的去除率仅为38.75%. 菌株HK13的嗜碱特性极大地拓宽了其反硝化脱氮pH的适用范围.

CN: 1—2； 2—4； 3—6； 4—8； 5—10； 6—12. 图4 CN对菌株HK13反硝化脱氮能力的影响Fig.4 Effects of CN on the denitrification ability of strain HK13

pH: 1—5； 2—6； 3—7； 4—8； 5—9； 6—10； 7—11.图5 pH对菌株HK13反硝化脱氮能力的影响Fig.5 Effects of pH on the denitrification ability of strain HK13

摇床转速(rmin): 1—0； 2—50； 3—100； 4—150； 5—200.图6 溶解氧对菌株HK13反硝化脱氮能力的影响Fig.6 Effects of dissolved oxygen on the denitrification ability of strain HK13

2.2.4溶解氧

高浓度溶解氧能够严重抑制硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性，进而影响脱氮效果[21]，但对于不同菌种，其溶解氧阈值差异较大[22]. 图6为菌株HK13在不同转速下的生长情况和脱氮效果. 由图6可见，该菌为兼性厌氧菌，在转速为0(静止)、50、100 r/min时，24 h的脱氮率均在95%以上. 适用于菌株HK13的最佳转速为100 r/min，此转速下有利于基质和菌的混合，使该菌株仅需16 h即可将ρ(NO3--N)由106.14 mg/L降至1.71 mg/L，且无亚硝酸盐积累. 这与SUN等[23]发现的Cupriavidussp. S1在转速为120 r/min时脱氮效果最好的结论基本一致. 当转速超过100 r/min时，菌株HK13的反硝化脱氮能力逐渐降低，结合菌株HK13在高转速下的脱氮效果同在低C/N下相似，解释为高浓度的溶解氧会消耗大量碳源，导致反硝化作用的碳源不足. 当转速为150和200 r/min时，菌株HK13对NOx--N的去除率分别为48%和35%，且均已出现较明显的亚硝酸盐积累.

2.2.5培养温度

温度是影响酶活性和反硝化速率的关键因素[24]. 图7为菌株HK13在不同温度下的生长情况和脱氮效果. 由图7可见，在15 ℃的低温下，菌株HK13在48 h的脱氮率为60.41%，平均脱氮速率为1.34 mg/(L·h)，优于蔡茜等[25]发现的耐冷反硝化菌株PseudomonasmonteiliiH97，其在15 ℃的平均反硝化速率仅为0.87 mg/(L·h). 当温度分别为20和25 ℃时，菌株分别在16和8 h后进入对数期，并分别在48和24 h脱氮率在95%以上. 当温度为30～40 ℃时，菌体的适应期均为8 h，16 h的脱氮率均在98%以上. 当温度达到45 ℃时，亚硝酸盐积累明显，脱氮率在30%左右. 菌株HK13适宜生长的温度范围为20～40 ℃，优于目前已分离出的大多数反硝化细菌.

培养温度℃: 1—15； 2—20； 3—25； 4—30； 5—35； 6—40； 7—45.图7 培养温度对菌株HK13反硝化脱氮能力的影响Fig.7 Effects of culture temperature on the denitrification ability of strain HK13

2.3 菌株HK13最优条件下的生长曲线和脱氮效果

图8 菌株HK13的生长曲线和脱氮效果Fig.8 Growing curve and denitrification of strain HK13

综上，菌株HK13的反硝化脱氮最优条件：以柠檬酸钠为碳源、C/N为8、pH为8～10、培养温度为35 ℃、摇床转速为100 r/min. 图8为菌株HK13在最优条件下的生长情况和脱氮效果. 由图8可见，菌株HK13在0～6 h为适应期，6～15 h为对数期，15～24 h为稳定期. 在初始ρ(NO3--N)为106.67 mg/L下，培养9 hρ(TN)降至68.00 mg/L，12 h降至7.90 mg/L，平均脱氮速率为8.26 mg/(L·h)，9～12 h的脱氮速率最高达20.03 mg/(L·h)，15 h的脱氮率为98.22%，存在0.65 mg/L的NO2--N积累，培养至24 h时，亚硝酸盐被彻底还原，TN去除率达99.16%. 目前已报道的PseudomonasstutzeriF1[26]、VibriodiabolicusSF16[27]、PseudomonasmendocinaTJPU04[28]、DiaphorobacterpolyhydroxybutyrativoransSL-205[29]、Pseudomonassp. HG-7[30]的平均脱氮速率均在2.08～6.11 mg/(L·h)之间. 由此可见，相较于已获得的大多数反硝化细菌，菌株HK13具有更高效的脱氮能力.

3 结论

a) 从某煤化工废水处理厂反硝化缺氧池活性污泥中筛选得到1株高效兼性厌氧反硝化菌HK13，经形态观察及16S rRNA基因序列分析，鉴定该菌为施氏假单胞菌属(Pseudomonasstutzeri).

b) 菌株HK13的反硝化脱氮最适条件：以柠檬酸钠做碳源、CN为8，培养温度为35 ℃、初始pH为8～10、摇床转速为100 rmin. 菌株HK13的反硝化脱氮快速高效，在初始ρ(NO3--N)为106.67 mgL下，12 h的脱氮率为92.62%，9～12 h的脱氮速率最高，可达20.03 mg(L·h)，16 h的脱氮率在98%以上，且无亚硝酸盐积累.

c) 菌株HK13的脱氮率在20～40 ℃均在99%以上，在15 ℃时也在60%左右. 当pH为10时，该菌株16 h的脱氮率为98.87%，且无亚硝酸盐积累，具有嗜碱特性. 反硝化菌株HK13具有较宽的环境温度和pH适用范围.