周大鹏，蓝蔚青,2，3*，莫雅娴，梅俊,2，3，冯豪杰，谢晶,2，3*

1(上海海洋大学食品学院，上海，201306)2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)3(食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海，201306)

海鲈鱼(Lateolabraxjaponicas)又名花鲈、四肋鱼，属鲈形目重要经济鱼类，主要分布于我国黄海、渤海地区。因其肉嫩味鲜，富含蛋白质、必需氨基酸和维生素等营养成分，深受消费者欢迎[1]。《2019年中国渔业统计年鉴》[2]显示，我国2018年鲈鱼海水养殖量达166 581吨，比2017年增长了6.38%，产量仅次于大黄鱼，其资源重要性不言而喻。然而，由于海鲈鱼等水产品的水分含量高，蛋白质易受内源酶与微生物影响发生降解，使其营养价值降低，继而发生腐败[2]。因此，在加工销售过程中，保证其新鲜口感与质量安全成为亟需解决的主要问题，采用简单有效且安全方便的处理措施对海鲈鱼的贮藏保鲜具有重要意义。

超声波是一种机械波，分为高频低强度(频率100 kHz～1 MHz，强度<1 W/cm2)与低频高强度(频率16 k～100 kHz，强度10～1 000 W/cm2)[3]。该技术属新型高效、绿色环保的加工处理技术，其作用机制是通过超声技术的机械效应、空化效应、热效应与化学效应，使样品组织产生物理破坏而发挥作用[4]。目前，超声处理技术已被广泛应用于食品杀菌、肉类腌制与嫩化加速等方面[5-6]。其中，李长乐等[7]研究发现，鲣鱼的肌原纤维蛋白经超声(20 kHz, 12 min)处理后，会改变其蛋白质结构，提高肌原纤维蛋白溶解度与乳化性，分子质量保持不变；WANG等[8]研究发现，牛肉经超声处理后，其肌原纤维分裂指数增加，蛋白质水解速度加快，剪切力降低，可有效改善牛肉嫩度。此外，超声还具有杀菌作用，该技术是利用超声波产生的细胞内空化效应，而空化气泡破裂时会生成羟基自由基，经重组形成过氧化氢与氢分子，具有化学抑菌效应，使菌体细胞膜变薄[9]。如PEDRS-GARRIDO等[10]使用30 kHz超声处理鲑鱼45 min，发现鲑鱼的嗜冷菌与嗜温菌数分别减少了1.5与1.1个对数值。而超声前处理对海鲈鱼冷藏期间品质及蛋白质特性变化研究还未见报道。

基于此，本实验拟采用超声法处理鲜海鲈鱼，由微生物、理化与蛋白质特性等指标，结合蛋白质荧光强度与感官分析综合评价超声处理不同时间对冷藏鲈鱼贮藏期间品质与蛋白质特性影响，以期为超声技术在水产品减菌化前处理与贮藏保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验原料

鲜活海鲈鱼(Lateolabraxjaponicas)购于上海市浦东新区芦潮港海鲜批发市场，选择体长(340±20 mm)，体重(500±30)g，样品个体均一，30 min内运回实验室进行实验。

1.2 主要药品试剂

Ca2+-ATPase测定试剂盒、总巯基(—SH)测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、H2O2、MgO、KCl、FeCl3、NaCl、NaHPO4、NaH2PO4等，均为分析纯，国药集团有限公司。

1.3 主要仪器设备

冷冻离心机(H-2050R)，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超声波清洗器(KQ-300DE)，昆山市超声仪器有限公司；pH/ORP计(FE20)，上海而立环保科技有限公司；荧光分光光度计(日立F-7100)，上海斯迈欧分析仪器有限公司；凯氏定氮仪(Kjeltec8400)，丹麦FOSS公司；质构仪(TA.XT Plus)，英国Stable Micro System公司。

1.4 原料处理

将鲜活海鲈鱼放入盛满碎冰的泡沫箱中致死，去头、去尾、去内脏后，由中部切分成两片，于无菌蒸馏水中清洗干净，沥干水分，随机分为4组。使用20 kHz，600 W超声处理5、10、20 min，分别记作U1、U2、U3，未超声的无菌水处理组样品为对照组(CK)。将4组样品处理后取出沥干，将其装入无菌保鲜袋中并做好标记，于4 ℃冰箱中贮藏。每隔2 d测定指标，不同组别测定时，取样部位保持一致。

1.5 实验方法

1.5.1 微生物指标(菌落总数与嗜冷菌数)

根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数的测定》[11]，称取5 g鱼肉于无菌均质袋中，加入45 mL 0.85%无菌生理盐水后拍打匀浆，以10倍梯度稀释。取3个合适的稀释度进行培养，移取1 mL稀释液于灭菌的培养皿内，及时将15～20 mL不同琼脂培养基倾注平皿，混合均匀。琼脂凝固后，翻转平板，放入相应温度下培养，菌落总数(total viable count,TVC)在30 ℃培养2 d后计数；嗜冷菌数(ssychrophile bacteria count,PBC)在7 ℃培养240 h计数。每个稀释度做3个平行，结果以lg(CFU/g)表示。

1.5.2 品质评价

1.5.1.1 pH值：按GB 5009.237——2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[12]测定样品pH值。取5 g碎鱼肉与45 mL蒸馏水置于烧杯中，混合均匀静置30 min后过滤，滤液使用pH计测定，3次平行。

1.5.1.2 质构分析(texture profile analysis, TPA)：参照LI等[13]方法略作修改。

1.5.1.3 总挥发性盐基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)：参照GB 5009.228——2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[14]对不同贮藏时期的样品予以分析，同一样品平行测定3次。

1.5.3 蛋白质特性

1.5.3.1 肌原纤维蛋白提取：参考LI等[15]方法略作修改，提取肌原纤维蛋白。

1.5.3.2 肌原纤维小片化指数(myofibril fragmentation index，MFI)：参考HOPKINS等[16]方法并作适当修改，2 g鱼肉加20 mL MFI提取缓冲液(0.1 mol/L KCl，1.0 mmol/L NaN3，1.0 mmol/L MgCl2，20 mmol/L K2HPO4，1.0 mmol/L EDTA，pH值为7.1，4 ℃)，12 000 r/min冰浴均质(30 s/次，2次)，12 000 r/min冷冻离心15 min。重复上述步骤后于沉淀中加入15 mL MFI缓冲液，混匀后双层纱布过滤，滤液为肌原纤维蛋白溶液。调节质量浓度至0.5 mg/mL，采用双缩脲法由酶标仪测定540 nm处吸光度，按公式(1)计算MFI值。

IMF=OD540×200

(1)

式中:OD540为滤液在540 nm处的吸光度值。

1.5.3.3 Ca2+-ATPase活性

根据Ca2+-ATPase测定试剂盒说明书中步骤测定。

1.5.3.4 总巯基含量

根据总巯基(—SH)测定试剂盒说明书中步骤测定。

1.5.4 内源性光谱分析

称取一定量样品于5 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)配成质量浓度为1 mg/mL溶液，取适量样品置于荧光分光光度计中测定。分析条件为激发波长290 nm，发射波长300～400 nm，狭缝宽均为5 nm，电压为700 mV。

1.5.5 感官分析

按照质量指标法(quality index method，QIM)[17]，参照蓝蔚青等[18]方法评估各组样品，将所有的指标评分相加形成QI值。

1.6 数据处理

实验数据处理与统计分析采用SPSS 17.0，结果以平均值±标准偏差表示，方差分析采用Turkey法，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌落总数与嗜冷菌数

引起水产品蛋白质和氨基酸分解代谢的主要因素是微生物，微生物的生长情况反映水产品的腐败程度[19-20]，水产品中微生物的TVC对数值达7.0 lg(CFU/g)时表明样品已腐败[21]。由图1可知，CK组样品在贮藏初期的TVC值为(3.26±0.23) lg(CFU/g)，表明其鲜度较高；采用超声处理后，各处理组样品的TVC值在0 d时均有所降低，且U2、U3组样品的TVC显著低于CK组(P<0.05)。随着冷藏时间的延长，各组样品的TVC值逐渐升高，CK组样品的TVC值上升趋势显著高于超声处理组(P<0.05)。到贮藏第8 天时，CK组样品的TVC值已达(7.25±0.06) lg(CFU/g)，而U2与U3组样品仍处于新鲜范围。样品冷藏期间的PBC值变化与TVC值相似，也以U2与U3组处理效果较好，表明超声处理可抑制海鲈鱼贮藏期间微生物的生长速度，延长其冷藏货架期，可用于其减菌化前处理。

图1 超声时间对海鲈鱼冷藏期间菌落总数与嗜冷菌数变化影响Fig.1 Effects of ultrasound time on the changes of TVC and PBC in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.2 pH值

pH值是衡量水产品腐败变质的重要指标之一。由图2可知，样品贮藏前期的pH值有所降低。可能由于水产品死后先后经历僵硬、解僵、自溶与腐败等阶段，在贮藏期间的pH值变化会出现先降后升变化趋势。贮藏后期，由于蛋白质分解释放出胺类物质，使得碱性物质积累，从而导致pH值逐渐上升，pH值越高，表明其腐败越严重[22]。样品在贮藏第4 天时，U2组样品的pH值升至7.00±0.07，可能由于超声破坏了组织与细胞结构，使样品的蛋白质构象随之改变，导致酸性基团埋藏，导致pH值上升[23]。U2组与U3组样品的pH值在贮藏后期无显著差异(P>0.05)，均低于对照组，表明超声处理可适当减缓样品贮藏期间pH值的上升，抑制其腐败。

图2 超声时间对海鲈鱼冷藏期间pH值变化影响Fig.2 Effects of ultrasound time on the changes of pH value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.3 TVB-N值

TVB-N是评价水产品新鲜度的重要指标，其值反映了贮藏期间样品鱼肉中蛋白质等物质在酶与细菌的作用下分解产生氨等挥发性碱类物质的含量[24-25]。当样品的TVB-N值≤15 mg/100 g为优级品，TVB-N值≤30 mg/100 g为合格品[26]。由图3可知，CK组样品的TVB-N值为(12.40±0.40) mg/100 g，表明样品较新鲜。随着贮藏时间的延长，各组样品的TVB-N值均呈上升趋势，3个处理组样品的TVB-N值均低于CK组。CK组样品在第6天时的TVB-N值达(18.37±1.52) mg/100 g，已超出优级品范围，而U2、U3组样品的TVB-N值分别为(11.95±0.41) mg/100 g与(12.01±1.28) mg/100 g，仍属优级品。CK组样品在贮藏第10 天时的TVB-N值已超出可接受上限，而U2、U3组均未达到该限值。可能由于超声的杀菌作用，抑制了样品中微生物生长，延缓其TVB-N值的升高[27]。该结果与TVC、PBC变化一致。

图3 超声时间对海鲈鱼冷藏期间TVB-N值变化影响Fig.3 Effects of ultrasound time on the changes of TVB-N value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.4 MFI值

MFI是反映肌原纤维断裂程度的参数，也是表征肉品嫩度的重要指标，其值与肌原纤维断裂程度及肉品嫩度成正比[8]。由图4可知，所有样品MFI值均随着贮藏时间的延长而升高，CK组样品的MFI值与处理组差异显著(P<0.05)，与HOPKINS等[28]研究结论相一致。可能由于鱼体死后，肌肉中的钙蛋白酶激活，引起Z盘相关肌原纤维蛋白降解，造成肌纤维断裂[29]。其中，MFI值与超声时间正相关，U3组样品的MFI值显著高于其他组，可能是处理时间越长，超声波的空化效应越强，使鱼片肌原纤维与结缔组织破坏严重，肌原纤维碎片化程度加快，MFI值相应增大[23]。

图4 超声时间对海鲈鱼冷藏期间MFI值变化影响Fig.4 Effects of ultrasound time on the changes of MFI value in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.5 Ca2+-ATPase活性

Ca2+-ATPase活性是用来评价肌球蛋白完整性的指标，蛋白质变性会导致酶活力改变[29]。由图5可知，各组样品的Ca2+-ATPase值随着贮藏时间的增加呈下降趋势，可能由于肌球蛋白球状头部上的巯基发生氧化和肌球蛋白聚集共同引起[30]。其中，U2与U3组样品的Ca2+-ATPase值急剧下降，到贮藏第10天时，其Ca2+-ATPase活性分别降至0.42与0.48 U/mg。可能由于长时间超声处理破坏了样品中肌球蛋白的完整性，导致蛋白质变性，酶活力降低[31]。

图5 超声时间对海鲈鱼冷藏期间Ca2+-ATPase活性变化影响Fig.5 Effects of ultrasound time on the changes of Ca2+-ATPase activity in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.6 总巯基含量

巯基是蛋白质中主要官能团之一，其含量变化是评价肌肉蛋白质氧化的重要指标[32]。如图6所示，各组样品的总巯基含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势，总巯基减少代表二硫键增多[33]。其中，U3组样品的巯基含量在整个贮藏期间下降迅速，到第10天时，其总巯基含量降至(2.45±0.11) μmol/g，而CK、U1、U2组分别为(3.89±0.23)、(3.50±0.56)和(3.21±0.30) μmol/g。可见，总巯基含量会随超声时间的延长而降低(P<0.05)，该结果与王静宇等[34]一致。超声处理会破坏样品的蛋白结构，且随超声时间的延长，其蛋白分子逐渐展开，内部巯基相应暴露，使活性巯基含量达到最大，促进了二硫键的形成[35]。

图6 超声时间对海鲈鱼冷藏期间总巯基含量变化影响Fig.6 Effects of ultrasound time on the changes of total sulfhydryl content in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.7 蛋白质三级结构

蛋白质内源荧光是指蛋白质分子内的荧光基团暴露在紫外线时发出的荧光现象。荧光强度的降低通常由于发色团在溶剂中或在蛋白质自身中与猝灭剂发生相互作用，蛋白质内部的荧光转移到表面，发生荧光猝灭[36]。因此，蛋白质内源荧光的变化可反映其构象变化[37]。色氨酸作为一种芳香族氨基酸，存在于蛋白质内核中，可发出通过荧光光谱法测定其荧光强度，进一步表征样品蛋白质的展开程度[38]。由图7-a可知，新鲜样品在335 nm波长处显示出最高的荧光强度，表明其蛋白结构完整度好。CK组样品中肌原纤维蛋白的内源荧光强度在整个贮藏期间急剧下降，可能由于海鲈鱼在贮藏期间，其肌原纤维蛋白结构逐渐展开，色氨酸残基等荧光物质暴露在极性环境中，使内源荧光强度降低。而超声处理可延缓样品荧光强度的下降，可能由于超声处理使色氨酸暴露于溶剂，发生荧光猝灭，导致蛋白质折叠结构解开。随着处理时间的延长，其蛋白质聚集程度加剧，色氨酸残基重新定位至蛋白质分子内部，荧光强度相应增加[39]。

图7 超声时间对海鲈鱼冷藏期间内源荧光强度变化影响Fig.7 Effects of ultrasound time on the changes of intrinsic fluorescence in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.8 TPA

由图8可知，各组鱼肉的硬度值、黏性值和弹性值均随着贮藏时间的延长而降低，这是源于贮藏期间的鱼肉样品蛋白质在组织蛋白酶、内源酶与微生物作用下发生不同程度的降解变性，肌纤维蛋白和肌肉结缔组织遭到破坏，质地变得松软，质构特性显著降低(P<0.05)[40]。样品的初始硬度、弹性与黏性值分别为(12 056±1 051)N、0.79±0.06与0.42±0.07，整个贮藏期间U2、U3组的硬度值与CK组差异显著(P<0.05)。CK组硬度较处理组均明显偏大，表明超声处理对鱼肉的硬度影响较大，可改变肉品嫩度，该结果与MFI值变化一致。超声波的空穴效应会使肌肉内部的压力与冲力急剧增加，破坏蛋白质的空间结构与完整性，一定程度上降低肌肉蛋白的机械性能[41]。JAYASOORIYA等[42]发现超声处理会降低牛肉剪切力与硬度、提高质构特性，改善品质。

图8 超声时间对海鲈鱼冷藏期间质构特性变化影响Fig.8 Effects of ultrasound time on the changes of TPA in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.9 感官分析

本文采用QIM法进行感官评价，QI值为0时表示样品品质最佳，QI值增大则说明鱼肉品质发生劣变。由图9可知，各组样品的感官分值在贮藏期间均呈上升趋势。其在贮藏初期差异不明显；当贮藏第4 天时，所有的处理组样品的感官分值明显低于CK组，而U2、U3组无显著差异(P>0.05)。样品在贮藏末期(8 d)时，出现不同程度的腐败。此时，CK组样品表面颜色黯淡，有浓烈的腥臭味，感官上已不可接受；U2、U3处理组样品表面稍有发白，无腐败气味，仍处于鲜度范围。可见，超声处理可延缓海鲈鱼样品贮藏期间的腐败变质。

图9 超声时间对海鲈鱼冷藏期间感官分值变化影响Fig.9 Effects of ultrasound time on the changes of sensory score in Lateolabrax japonicas during refrigerated storage

2.10 相关性分析

通过对不同超声时间前处理后海鲈鱼冷藏期间的TVC、TVB-N值、pH值、MFI值与硬度值进行相关性分析。由表2可知，MFI值是衡量肌原纤维平均长度的指标，较高MFI值表现为较大程度的肌原纤维断裂，其与硬度值显著相关(P<0.05)。超声处理后鱼片的MFI值均增加，从而硬度下降，嫩度增加[43]。

表2 超声处理海鲈鱼冷藏期间指标间相关性分析Table 2 Correlation analysis between different parameters of Lateolabrax japonicas with ultrasound treatment during refrigerated storage

TVB-N值表示样品蛋白质的分解程度，其与TVC、pH值等指标显著相关(P<0.05)，这是由于冷藏时间延长，样品中的蛋白质在微生物的作用下发生降解，含氮物质相应增多，pH值上升[44]。

3 结论

通过不同超声时间处理后，研究其对海鲈鱼冷藏期间品质变化与蛋白质变化影响，结果表明，超声处理可较好抑制鱼肉样品贮藏期间的微生物生长，延缓pH值与TVB-N值升高，增大其MFI值，使硬度值降低，嫩度增加，改善肉质。然而，长时间超声处理会破坏样品的蛋白结构，使蛋白分子展开，促进二硫键的形成，使Ca2+-ATPase活性与总巯基含量降低，导致蛋白质变性，超声处理能减缓样品中内源性荧光强度的降幅。其中，由TVC与TVB-N值，结合其他指标可知，以超声处理10 min综合效果最佳。与对照组相比，该处理可使海鲈鱼的冷藏货架期至少延长2 d。因此，超声处理能明显改善水产品的贮藏品质，延长其冷藏货架期，可用于其贮藏前处理。