张宇，潘洁琼，满都拉，孙子羽，陈忠军

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古自治区 呼和浩特，010018)

食醋是我国传统调味品，小米、大米、高粱等多种谷物均可作为酿醋原料。小米因氨基酸、维生素、矿物质种类齐全，营养丰富的特点已成为酿造醋的优选原料。挥发性香气成分是反映小米醋品质的特征性标志之一，其种类、含量及比例是影响最终风味的关键因素。目前通过液液萃取、蒸馏萃取以及固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)等前处理方法，已经从食醋中鉴定出的挥发性化合物主要包括酸类、醇类、酯类、醛类、杂环类等[1-3]。SPME是近年来发展起来的一种检测食品风味物质的新技术，常与气质联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)来分析和鉴定风味物质[4-6]。徐清萍等[7]研究了全酶法液态发酵工艺在小米醋酒精发酵阶段的应用，所制备的食醋在风味及营养成分的含量上都很难达到固态发酵食醋的指标；于迪等[8]根据山西老陈醋的酿造工艺酿造小米醋并测定发酵过程中理化指标的变化，分析了小米醋的挥发性香气成分。本文以小米为原料，谷糠为填充料，采用固态法酿造小米醋，对不同的发酵阶段、陈酿阶段及陈酿方式下的挥发性香气成分进行了研究，为提高小米醋的风味和品质提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米、谷糠,市售；安琪酿酒曲，安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌沪酿101，沂源康源生物科技有限公司；结晶酚、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸[9]、HCl、NaOH、NaCl、NaHSO3为分析纯，上海化学试剂有限公司。

1.2 实验设备

FA-1电子天平,上海菁海仪器有限公司；PHS-3C精密pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司；SIGMA 3-18KS离心机,上海创未生物技术有限公司；紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；气相色谱-质谱联用仪、手动式SPME手柄,美国赛默飞世尔科技公司；

1.3 实验方法

1.3.1 小米醋的酿造工艺[10]

1.3.2 操作要点

蒸煮：使小米蒸煮后达到熟而不黏的状态。

降温：蒸煮后小米摊晾至25 ℃左右。

糖化酒化阶段：添加谷糠使含水量达到60%。将安琪酿酒曲在35～42 ℃的温水中活化30 min后添加，添加量为原料的0.8%。边糖化边酒精发酵，待酒醅中酒精度达到8%左右结束。

醋化阶段：酒醅中补加谷糠使其含水量为50%，将活性醋酸菌以原料0.15%的添加量加入进行醋酸发酵，每12 h进行一次人工翻醅来供氧及降温，连续3 d测定总酸含量基本保持不变时发酵结束。

淋醋：醋醅用80 ℃的热水按质量比1∶1浸泡16 h，然后进行淋醋。

陈酿：醋醅压实于缸内密封保存；醋液密封后4 ℃保存。

1.3.3 理化指标的测定方法

酒精度：参照 GB 5009.225—2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》进行测定；发酵温度：使用温度计进行测定；还原糖：采用3,5-二硝基水杨酸比色法[11]进行测定；总酸、pH：参照GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》进行测定。

1.3.4 挥发性风味物质的测定

1.3.4.1 取样

分别取酒精发酵第5、7天,醋酸发酵阶段第2、5、8、10天的发酵醅；浸淋得到的新醋；陈酿1个月、2个月的醋液；陈酿1个月、2个月的醋醅。

1.3.4.2 样品处理方法

将首次使用的固相微萃取头在进样口老化至无杂峰，老化温度230 ℃，时间30 min。称取3 g醋醅加入样品瓶中，并加入6 mL H2O和1.5 g NaCl，置于40 ℃加热平台上预热10 min(吸取稀释20倍的醋液6 mL，放入15 mL干净的样品瓶中并加入1.5 g NaCl[12])，将萃取头插入瓶中，推出纤维头并与醋液面保持1.5 cm的距离，萃取温度40 ℃，萃取时间40 min。随后抽回纤维头，并将萃取头插入气相色谱进样口，推出纤维头于230 ℃解吸3 min后启动仪器采集数据[13]。

1.3.4.3 GC-MS条件参数

色谱条件：色谱柱为 DB-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气，流量1.0 mL/min，不分流，进样口温度230 ℃。柱温：起始温度35 ℃，以5 ℃/min的速度升至180 ℃，再以10 ℃/min的速度升至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：接口温度230 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描质量范围33～450 u。

1.3.4.4 定性分析

数据处理:对照谱库鉴定得到的成分，结合保留时间、质谱图谱、保留指数和相关文献[2,14]定性。

2 结果与分析

2.1 糖化及酒精发酵阶段

2.1.1 理化指标的变化

酒精发酵阶段，霉菌分泌的糖化酶将淀粉转化成葡萄糖，同时酵母菌分泌的酒化酶在无氧条件下将葡萄糖转化为酒精[15]。如图1所示，还原糖主要来源于原料的糖化，酒精发酵阶段开始时微生物大量繁殖，糖化力增强，还原糖的含量迅速增长到最大含量。由于酒醅中酶系的积累，还原糖在多种酶的作用下逐渐转化为酒精，导致其含量逐渐降低[16]。酒精发酵前期，作用强，乙醇和二氧化碳产量大，发酵酒醅酒味突出，表面气泡明显，糖分消耗快。在酒精发酵第2天，由于酒醅中各物质反应会生成乙醛，乙醛逐渐氧化成乙酸，同时酒醅中的葡萄糖部分会转化成葡萄糖酸，而且乳酸菌多样性在酒精发酵阶段逐渐增加[17]。随着酸类物质的增长，pH不断降低，但在酒精发酵后期pH基本不变，并维持在4.5～5之间。酵母菌将糖转化为乙醇的过程会放出少量热量，所以整个酒精发酵过程中品温基本维持在25～27 ℃之间。

图1 酒精发酵阶段pH、温度、还原糖的变化Fig.1 Changes in pH，temperature and reducing sugar during alcohol fermentation

2.1.2 挥发性风味物质

小米醋酿造过程中，影响其产量和品质的因素很多，其中酒醅的品质及风味是最为重要的因素[18]。在糖化酒精发酵阶段，通过固相微萃取和气质联用(SPME-GC-MS)技术测定小米醋酒精发酵第5、7天，酒醅中挥发性香气成分，如表1所示。发酵第5天，的发酵醅中共测得有35种物质，而发酵第7天,醅中测得41种物质，包括酯类、醇类、醛类、酸类等。

表1 酒精发酵阶段挥发性风味物质的相对含量 单位：%Table 1 The relative contents of volatile flavor substances in alcohol fermentation stage

相比其他香气成分，酯类物质种类最多，其中相对含量较高的为乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯等。这是因为在发酵过程中，醇类物质与底物中的酸类物质很快反应后生成酯类物质。在酒精发酵第5天测得14种脂类，相对含量为10.08%，而第7天酯类物质增加到16种，产生了苯甲酸乙酯及丙酸乙酯，其相对含量增高到12.45%。醇类物质相对含量最高，第5天酒醅中检测出9种，而第7天共检测出14种，其中相对含量较高的是乙醇、苯乙醇、异戊醇、2-甲基-1-丁醇。酒精发酵阶段是酵母菌的繁殖旺盛期，发酵底物糖形成大量乙醇[19]。酒精发酵结束时乙醇的相对含量显著增高达到64.31%，这与北京米醋的相关研究结果相似[20]。有研究表明，高级醇是酵母菌酒精发酵的正常副产物, 主要由正丙醇、异丁醇 (2-甲基-1-丙醇)、活性戊醇 (2-甲基-1-丁醇) 和异戊醇 (3-甲基-1-丁醇)组成[21]。酒精发酵阶段产生的高级醇相对含量在第7天降低，这可能是部分高级醇与酸类生成酯的缘故。此外，醛类物质、酸类物质及烷烃类物质在酒精发酵阶段均有检出，但相对含量较小，变化不大。

2.2 醋酸发酵阶段

2.2.1 理化指标的变化

醋酸发酵阶段是酸性物质形成的主要阶段，谷糠作为辅料及填充料与酒醅混合形成醋醅，能为醋酸菌提供营养，进行大量繁殖并抑制了霉菌、酵母菌等其他微生物的生长[22-23]。如图2所示，由于环境适宜，原料充足，醋酸菌生长旺盛，氧化一些化合物生成酸类物质，因此总酸含量上升明显。醋酸发酵中期，总酸含量迅速增加到6.2 g/100 mL，酸度较高可抑制微生物的生长，防止小米醋的腐败变质。发酵到第8天后，由于营养物质的消耗和有机酸的积累，醋酸菌等产酸菌代谢缓慢，总酸含量基本稳定不变。乙醇被氧化生成乙酸的过程中会产生大量生化热，导致醋醅温度上升较快，之后通过人工翻醅降温，缓慢的降温过程有利于将残余的淀粉、糖、乙醇继续转化，提高产量。pH在发酵第5天由于乙酸的生成而下降明显，这与熊越[13]在四川麸醋的研究中情况相似。随着发酵的进行，由于缓冲体系的形成，pH稳定在3.65左右[24]。资料显示[25]，pH值处于3.6～3.9对醋酸菌的生长和产酸有利。

图2 醋酸发酵阶段pH、温度和总酸的变化Fig.2 Changes in pH，temperature and total acid during acetic acid fermentation

2.2.2 挥发性风味物质的变化

如表2所示，醋酸发酵阶段，由于酯化反应的进行，酯类物质含量持续上升，到第8天时达到最大值64.83%，之后由于酯类物质的挥发性较强，醋酸发酵结束时相对含量下降到24.33%。其中相对含量较高的酯类为乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等。与酒精发酵阶段相比，在醋酸菌的作用下乙醇大量转化为乙酸以及醇类物质与酸类物质发生酯化反应生成酯类物质，故醇类物质相对含量持续下降。而在醋酸发酵过程中，苯乙醇的含量不断升高，并在第8天达到最大相对含量21.15%，之后逐渐下降。这是因为苯乙醇是苯丙氨酸经Strecker降解产生醛，然后再还原生成的[26]。随着醋酸发酵时间的延长，在脱氢酶的作用下醛类物质种类及含量下降，而酸类物质的种类及含量都有所增加，其中乙酸含量从0.54%不断升高到50.78%。醋酸发酵过程中生成一些在酒精发酵阶段未检测到的酸类物质如异丁酸、异戊酸、正己酸等。醋酸发酵阶段，杂环类化合物种类较多,且其种类及含量在不断变化。通过SPME-GC-MS技术测得结果中，杂环类化合物在小米醋发酵过程中相对含量较低。

表2 醋酸发酵阶段挥发性风味物质的相对含量 单位：%Table 2 The relative content of volatile flavor substances in acetic acid fermentation stage

2.3 陈酿期挥发性风味物质的变化

一般固态酿造食醋的陈酿有两种方式，醋醅陈酿和醋液陈酿。结果如表3所示，陈酿2个月后的醋醅及醋液中酯类物质相对含量都明显降低，其中部分酯类物质陈酿后消失，与熊越[13]在四川麸醋发酵过程中风味物质的变化研究结果相似，可能是由于酸类含量的增加造成过酸环境抑制了微生物的活性，而且酯类的分解没有终止。分子量小、低沸点酯类化合物的芳香性较强，更具特色，而沸点较高的脂肪酸乙酯有某种耐人寻味的香气，乙酸苯乙酯具有较好的花香和玫瑰香味[27]。本次实验研究中乙酸苯乙酯在陈酿期先明显增加后略有减少。陈酿后醋醅、醋液中酯类物质含量较新醋培、新醋液分别减少了6.01%和3.68%通过陈酿后，酸类物质的种类及含量明显提高，这些酸可能是氨基酸降解后并经氧化或还原生成的产物，也可能是饱和脂肪酸氧化降解形成的[17]。其中醋醅中酸类物质含量在陈酿2个月后提高了12.76%，而醋液在陈酿2个月后提高了6.22%。醇类物质种类及含量在2种陈酿方式下都明显降低，尤其苯乙醇含量降低明显，这与邝格灵等[28]在研究不同陈酿期恒顺香醋的风味物质情况相符。羰基化合物是由α-酮酸经脱碳酸而生成的醛类和脱羟基而生成的酮类构成[22]。陈酿阶段醛类和酮类的种类及含量都明显增多，这说明大多数醛和酮是在陈酿阶段产生的，这与黄达明等[29]在不同陈酿期镇江香醋的香气成分研究中情况相符。陈酿2个月后，正己醛、苯乙醛、苯甲醛、异戊醛、糠醛、壬醛等相对含量明显增加，这些醛类物质具有花香气味，可改善食醋的品质[30]。其中苯甲醛具有苦杏仁香味[31]，相关研究表明苯甲醛可能来自苯甲醇的氧化或者微生物对苯丙氨酸、酚类物质以及苯乙酸和羟基苯甲酸等物质的作用产生[32]。食醋中的酮类化合物主要是经过微生物氧化、氨基酸降解以及不饱和脂肪酸的热氧化分解而产生的。陈酿2个月后，3-乙酰基-2-丁酮、4-羟基-2-丁酮等出现并增多，这些酮类化合物一般具有甜的花香味和果香风味。醋醅陈酿2个月后醛、酮类化合物种类明显多于陈酿醋液。其中醋醅陈酿后醛类化合物含量增加了3.62%，而醋液陈酿后醛类物质只增加了2.65%。陈酿后杂环化合物种类及含量同样有所增多，为小米醋提供了特有的风味[30]。

表3 陈酿期挥发性风味物质的相对含量 单位：%Table 3 The relative content of volatile flavors during aging

续表3

3 结论

采用固态法酿造小米醋，不同发酵阶段测定理化指标，发现糖化及酒精发酵阶段还原糖被不断的消耗,含量降低明显，温度及pH呈先降低后平稳的趋势。醋酸发酵阶段总酸含量明显升高，温度在发酵中期升高后降低，而pH在整个发酵过程中持续降低到3.6左右。小米醋中挥发性风味物质种类丰富，香气成分包括酸类、醇类、酯类，醛类、酮类和杂环类化合物，这些物质共同决定了小米醋的风味及品质。采用SPME-GC-MS技术分析小米醋在不同发酵阶段的挥发性香气成分。结果表明，糖化及酒精发酵阶段，随着发酵时间的延长，酯类含量及种类增加，醇类物质除乙醇含量增加外，高级醇含量有所下降。醋酸发酵阶段，随着时间的延长，风味物质种类明显增多，其中酯类和酸类物质含量增加，而醇类、醛类含量有所下降，呋喃类化合物、含苯化合物、胺类化合物及其他类化合物在小米醋发酵过程中均有检测出，但相对含量较低，对风味贡献较少。通过陈酿，酸类物质种类及含量明显升高；酯类物质虽有所减少，但其相对含量仍占较高比例，对小米醋风味贡献较大；醛类、酮类物质含量在陈酿2个月后明显增加。说明通过陈酿后小米醋风味及感官有明显提升，且醋醅陈酿方式更有利于小米醋风味物质的提升。