汪芷玥 周际松 汤凯

摘要：湖北省麻城福白菊为中国国家地理标志产物，绿原酸是其中含量较高的生物活性物質。采用微波辅助提取法对其中的绿原酸提取工艺进行优化，并测定绿原酸的总抗氧化能力及其清除超氧阴离子自由基的能力。选取微波时间、微波功率、料液比等3个变量进行单因素试验，利用响应面法对其提取工艺进行优化。结果表明，最佳工艺参数组合：微波功率为640 W，料液比为1 g ∶ 20 mL，微波时间为25 s。在此最优条件下，绿原酸提取率可达6.25%。抗氧化活性试验结果表明，福白菊中绿原酸具有良好的抗氧化性，并且当福白菊中绿原酸质量浓度达到1.0 mg/mL时，其总抗氧化能力及清除超氧阴离子自由基的能力最强。

关键词：菊花;绿原酸;微波辅助提取;响应面法;抗氧化活性

中图分类号： TS201.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）15-0240-06

麻城福白菊（Chrysanthemum morifolium cv. Fubaiju）是一种兼具食用和药用价值的保健型药材，被视为“药膳佳肴，饮中极品”，主要种植于以湖北省麻城市福田河镇为中心的大别山区域[1]。凭借当地良好的生态环境及地理优势，麻城福白菊被评为中国国家地理标志产物，具有清热解毒、平肝明目的功效[2]。研究发现，福白菊中绿原酸、木樨草苷等成分含量均高于其他种菊花[3]。而在福白菊的众多提取物中，绿原酸是其发挥一定功效的主要活性成分。绿原酸是一种苯丙素类物质，具有抗菌、降压、利胆、抗氧化等作用[4-5]，它在食品、医药及化妆品等领域中有着广泛的应用[6]，被称为“植物黄金”[7]。近几年来，随着人们对生物资源的重视，绿原酸的提取工艺受到广泛关注。麻城福白菊作为大别山优质特色资源，是获取绿原酸的良好来源。

目前，国内外对麻城福白菊遗传特性的研究较多[8]，而对其活性成分的研究相对较少[9]，麻城福白菊的丰厚资源尚未得到充分利用。本研究采用微波辅助提取的方法从麻城福白菊中提取绿原酸，选择微波时间、微波功率、料液比等进行单因素试验，通过响应面分析法优化福白菊中绿原酸的最佳提取工艺，同时探究福白菊中绿原酸的抗氧化活性，以期为后续麻城福白菊的开发及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂 福白菊，产自湖北省麻城市福田河镇;无水乙醇、维生素C、铁氰化钾、氯化铁、三氯乙酸、焦性没食子酸等（均为分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司;三羟基氨基甲烷（分析纯），购自阿拉丁试剂（上海）有限公司;盐酸（分析纯），购自中平能化集团开封东大化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备 FW100高速万能粉碎机，购自天津市泰斯特仪器有限公司;标准检验筛，购自上虞市五四纱筛厂;AL204电子天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;WBFY-201微波化学反应器、SHZ-D（Ⅲ）环水真空泵，均购自巩义市予华仪器有限责任公司;723型可见分光光度计，购自上海光谱仪器有限公司;H/T18MM台式高速离心机，购自湖南赫西仪器装备有限公司;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅，购自天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 绿原酸的提取工艺流程 将已经干燥的麻城福白菊放入粉碎机中粉碎后过80目筛备用。准确称取0.5 g福白菊粉末和80%乙醇溶液，按照一定的配比混合后移入微波反应器中，设置一定的微波时间、微波功率，对其中的绿原酸进行提取。将处理好的溶液进行抽滤，再将滤液转移到25 mL容量瓶中，加80%乙醇溶液定容，摇匀。用移液管移取1 mL溶液于100 mL容量瓶中，加80%乙醇溶液定容。以80%乙醇溶液作为空白对照，于分光光度计中测定待测液在328 nm波长下的吸光度[10]。

1.2.2 绿原酸提取率的计算 利用绿原酸标准样品绘制标准曲线。在328 nm波长下测定吸光度，根据所得绿原酸标准曲线公式D=41.757C+0.0387及公式（1）计算绿原酸提取率（y）[11]：

y=CVn/m×100%。（1）

式中：D为吸光度;C为绿原酸浓度，mg/mL;V为体积，L;n为稀释倍数;m为福白菊粉末质量，g。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 微波时间对福白菊绿原酸提取率的影响 分别称取0.5 g福白菊粉与80%乙醇溶液，按照料液比1 g ∶ 20 mL混合，设定微波功率为400 W，在微波时间分别为10、20、30、40、50 s的条件下进行3次平行试验，在328 nm波长下测定其吸光度，并计算绿原酸提取率。

1.2.3.2 料液比对福白菊绿原酸提取率的影响 分别称取0.5 g福白菊粉与80%乙醇溶液，按照设定的料液比混合，设定微波时间为30 s，微波功率为400 W，在料液比分别为1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL的条件下进行3次平行试验，在328 nm波长下测定其吸光度，并计算绿原酸提取率。

1.2.3.3 微波功率对福白菊绿原酸提取率的影响 分别称取0.5 g福白菊粉与80%乙醇溶液，按照料液比1 g ∶ 20 mL混合，设定微波时间为30 s，在微波功率分别为80、240、400、640、800 W的条件下进行3次平行试验，在328 nm波长下测定其吸光度，并计算绿原酸提取率。

1.2.4 响应面法优化提取工艺 根据单因素试验结果，以料液比、微波功率、微波时间等3个因素为自变量，以绿原酸提取率为响应值，用Box-Behnken design法设计试验方案，得出微波辅助提取麻城福白菊中绿原酸的最佳工艺条件[12]。试验因素与水平见表1。

1.2.5 福白菊中绿原酸抗氧化活性的测定方法 总抗氧化能力测定方法[13]：取0.2 mL不同质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的样品溶液，分别加入2.5 mL磷酸盐溶液（pH值为6.6）和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。混匀后于1 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液，加入5 mL蒸馏水和 1 mL 0.1% FeCl3溶液，充分振荡后，于分光光度计中在700 nm波长下测定待测液吸光度，并以相同浓度的维生素C溶液作为阳性对照。吸光度越高，表明其总抗氧化能力越强。

超氧阴离子清除能力测定方法[14]：取0.2 mL不同质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的样品溶液，加入5.7 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值为8.2），于25 ℃水浴10 min，再加入0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚。迅速摇匀后于分光光度计中在320 nm波长下测定反应时间为1 min时的吸光度Dx，同时以等浓度的样品溶液作为参比，以扣除样品本身所带的颜色干扰;用等体积的水代替样品，以Tris-HCl作为空白参比，测定反应时间为 1 min 时的吸光度D0，并以相同浓度的维生素C溶液作为阳性对照。在320 nm波长下，福白菊中绿原酸对超氧阴离子的清除能力计算公式如下：

清除率=（D0-Dx）/D0×100%。（2）

式中：D0为Tris-HCl空白对照液的吸光度;Dx为样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对福白菊绿原酸提取率的影响 在料液比为 1 g ∶ 20 mL、微波时间为30 s的固定条件下，改变微波功率，研究其对绿原酸提取率的影响。由图1可知，微波功率在80～400 W范围内时，随着微波功率的增加，提取率升高;当微波功率为400 W时，绿原酸提取率达到最大值（5.75%）;当微波功率继续增加时，绿原酸提取率呈现出下降的趋势，这是由于当微波功率过大时，温度升高导致绿原酸的结构遭到破坏[15]，从而影响了福白菊中绿原酸的提取率。

2.1.2 微波时间对绿原酸提取率的影响 在料液比为 1 g ∶ 20 mL、微波功率为400 W的固定条件下，改变微波时间，研究其对绿原酸提取率的影响。由图2可知，当微波功率为10～20 s时，绿原酸提取率随微波时间的增加而升高;当微波时间为20 s时，绿原酸提取率达到最大值（5.79%）;当微波时间继续增加时，绿原酸提取率呈现出下降的趋势，这是由于微波时间过长时，微波能量聚集，使得细胞壁迅速破裂，水分立即蒸发，绿原酸来不及融入乙醇[16-17]，另一方面，由于乙醇具有挥发性，随着微波时间的延长，其有效浓度也逐渐降低，从而影响了提取率。

2.1.3 料液比对绿原酸提取率的影响 在微波功率为400 W、微波时间为30 s的固定条件下，改变料液比，研究其对绿原酸提取率的影响。由图3可知，当提取料液比为1 g ∶ 10 mL至1 g ∶ 20 mL时，绿原酸提取率随之升高;当料液比为 1 g ∶ 20 mL 时，绿原酸提取率达到最大值（6.03%）;当料液比为 1 g ∶ 25 mL 至1 g ∶ 30 mL时，绿原酸提取率呈现下降的趋势，这可能是因为当福白菊原料减少时，提取得到的绿原酸也减少。

2.2 响应面试验优化

2.2.1 试验设计与结果 根据单因素试验的结果，以绿原酸提取率为响应值，采用Box-Behnken试验设计对3个因素[微波时间（A）、微波功率（B）、料液比（C）]，进行3因素3水平的响应面试验分析，试验设计及结果见表2。

利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合，得到绿原酸提取率（Y）与微波时间（A）、微波功率（B）和料液比（C）的二次多项回归模型方程为

Y=6.25+0.029A+0.065B+0.069C+0.022AB+0.22AC-0.058BC-0.22A2-0.10B2-0.13C2。

对该模型进行方差分析，由表3可知，该模型（P<0.000 1）极显著;失拟值不显著（P=0.313 1>0.05），表明该模型不失拟，十分合理;R2=0.980 6，表明该模型的相关性较好，能良好地反映3个因素与绿原酸提取率之间的关系;R2adj=0.955 6，表明该模型具有较好的相关性[18]。综上，可运用该模型对福白菊中的绿原酸进行分析和检验。在一次项中，A（微波时间）对绿原酸提取率的影响不显著，B（微波功率）和C（料液比）对绿原酸提取率的影响极显著（P<0.01）[19];在交互项中，AB对绿原酸提取率的影响不显著（P=0.098 9>0.05），BC对绿原酸提取率的影响显著（P<0.05），AC对绿原酸提取率的影响极显著（P<0.000 1），表明微波時间和料液比、微波功率和料液比之间存在交互作用;在二次项中，A2、B2、C2对绿原酸提取率的影响皆表现为极显著（P<0.01）。3个因素对福白菊绿原酸提取率的影响主次顺序表现为料液比>微波功率>微波时间。

优化得到的麻城福白菊中绿原酸微波辅提的最佳参数组合：微波功率为640 W，料液比为 1 g ∶ 20 mL，微波时间为25 s，在该条件下，绿原酸提取率的理论值为6.28%。

2.2.2 响应面分析 响应面及等高线可直观清晰地反映2个因素之间的交互作用，当响应面越趋近平面时，表明2个因素之间的交互作用越弱;当响应面越趋近拱形时，表明2个因素之间的交互作用越强;当等高线呈现椭圆形时，表明2个因素之间的交互作用较强，对绿原酸提取率的影响显著[20]。

由图4-a可知，在微波时间和微波功率对绿原酸提取率的影响方面，对应的响应面较平缓，表明微波时间和微波功率之间的交互作用不显著[20];图4-c中的响应面趋近拱形，等高线较密集，呈现椭圆形，表明微波时间和料液比之间的交互作用显著;图4-e的响应面坡度较陡，图4-f的等高线呈现椭圆形，表明微波功率与料液比之间的交互作用较明显。

2.2.3 验证试验 采用响应面分析法优化得到最佳工艺条件：微波时间为25 s，微波功率为640 W，料液比为1 g ∶ 20 mL，在此条件下绿原酸的理论提取率为6.28%。在最优工艺条件下进行3次平行验证试验，测得绿原酸的实际提取率为6.25%，与预测结果基本一致，可见该模型有效。

2.3 福白菊中绿原酸抗氧化活性的测定

2.3.1 总抗氧化能力测定结果 如图5所示，随着样品质量浓度的增加，吸光度逐渐提高，即福白菊中绿原酸的总抗氧化能力逐渐增强[21];当绿原酸质量浓度为1.0 mg/mL时，吸光度达到最大值，在该浓度下绿原酸的总抗氧化能力最强，与同浓度下维生素C溶液的总抗氧化能力比较可知，福白菊中绿原酸有较强的抗氧化能力。

2.3.2 超氧阴离子清除能力测定结果 如图6所示，随着样品质量浓度的增加，福白菊中绿原酸对超氧阴离子的清除能力逐渐增强;当绿原酸质量浓度为1.0 mg/mL时，清除率达到88.97%，与该浓度下维生素C对超氧阴离子的清除率基本持平。以上结果表明，福白菊中绿原酸对超氧阴离子有较强的清除能力。

3 结论

综上，以麻城福白菊为原料，以福白菊中绿原酸的提取率为指标，利用微波辅助提取的方法，在单因素试验的基础上，通过响应面分析法得到提取麻城福白菊中绿原酸的最佳工艺条件：微波功率为640 W，微波时间为25 s，料液比为1 g ∶ 20 mL。绿原酸提取率在该条件下可达6.25%。与其他方法相比，微波辅助提取法更加简单、高效，为麻城福白菊中绿原酸的进一步开发奠定了理论基础。另外，当绿原酸质量浓度达到1.0 mg/mL时，其抗氧化能力达到最大值，是同浓度下维生素C抗氧化能力的79.9%，表现出绿原酸较高的抗氧化能力;在该浓度下，绿原酸对超氧阴离子的清除能力最强，为同浓度下维生素C清除能力的93.7%，表明福白菊中绿原酸对超氧阴离子具有较强的清除能力，可为后续利用麻城福白菊研制具有抗氧化活性的产品提供科学依据。

参考文献：

[1]徐 雷，刘常丽，王慧弟，等. 福白菊花粉活力和柱头可授性研究[J]. 中药材，2012，35（10）：1546-1550.

[2]秦贺兰，游 捷，高俊平. 菊花18个品种的RAPD分析[J]. 园艺学报，2002，29（5）：488-490.

[3]徐 雷，谢彩香，胡志刚，等. 湖北道地药材福白菊产地生态适宜性数值区划研究[J]. 时珍国医国药，2016，27（4）：954-957.

[4]Yusaku N，Kuniyo I. Inhibitory effects of chlorogenic acids from green coffee beans and cinnamate derivatives on the activity of porcine pancreas α-amylase isozyme I[J]. Food Chemistry，2011，127（4）：1532-1539.

[5]冯 攀. 杜仲叶中绿原酸提取纯化绿色工艺的研究[D]. 西安：陕西科技大学，2014.

[6]Wianowska D，Gil M. Recent advances in extraction and analysis procedures of natural chlorogenic acids[J]. Phytochemistry Reviews，2019，18（1）：273-302.

[7]张 露，陈豆弟. 绿原酸提取工艺研究进展[J]. 杭州化工，2012，42（4）：4-6，11.

[8]李 伦，熊永兴，赵玉霞，等. 麻城福白菊的ISSR遗传图谱的构建[J]. 中国药师，2014，17（12）：2059-2063.

[9]熊永兴. 福白菊种质资源研究及其优良品系的优选[D]. 武汉：湖北中医药大学，2014.

[10]常学峰. 金银花中绿原酸的提取纯化新方法的研究[D]. 青岛：中国石油大学，2013.

[11]张明明，黄 芳，张长丽. 响应面法优化野菊花中绿原酸的提取工艺[J]. 江苏农业科学，2014，42（11）：327-329.

[12]刘 刚，秦 高，任 雪. 响应面法优化葵花粕中绿原酸提取工艺[J]. 安徽农业科学，2012，40（21）：11050-11052，11058.

[13]王 化，李梦莎，何丹娆，等. 3种野生越桔属植物浆果提取物抗氧化活性比较研究[J]. 中国酿造，2018，37（10）：148-152.

[14]崔珊珊，毕凯媛，吴 杰，等. 响应面法优化树莓鞣花酸提取工艺及其体外抗氧化活性[J]. 食品工业科技，2019，40（1）：149-155，161.

[15]帅丽乔娃，郑国栋，张清峰，等. 响应面法优化微波提取菝葜绿原酸工艺[J]. 中国食品学报，2015，15（6）：102-109.

[16]丘秀珍，何慕贞. 微波辅助提取百香果中绿原酸的工艺研究[J]. 韶关学院学报，2012，33（2）：31-34.

[17]Mills C E，Oruna-Concha M J，Mottram D S，et al. The effect of processing on chlorogenic acid content of commercially available coffee[J]. Food Chemistry，2013，141（4）：3335-3340.

[18]張崇军，唐贤华，赵 龙，等. 响应面法优化大曲中黄曲霉毒素B1提取工艺[J]. 中国酿造，2018，37（12）：132-136.

[19]刘振春，钱 月. 响应面优化超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸工艺[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，44（10）：157-164.

[20]容晨曦，张秀玲，李铁柱，等. 响应面试验优化微波法提取刺玫籽原花青素的工艺[J]. 食品科学，2016，37（18）：41-46.

[21]郭毓菲，张诗泉，王汉迪，等. 超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化及其抗氧化活性探究[J]. 中国酿造，2018，37（12）：160-164.