邵顺儒 杨冬芝 侯盛

摘要：旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺，并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明，膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上，分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试，膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明，低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明，室温处理时间≥0.5 h，小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求，建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

关键词：注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体;膜过滤病毒去除;低pH值孵放病毒灭活;分子排阻色谱纯度;蛋白质回收率;半数组织培养感染剂量

中图分类号：R915  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）15-0077-06

根据《药品注册管理办法》要求，对于动物源性单克隆抗体重组生物制品，在工艺上要进行病毒去除/灭活验证。按病毒去除/灭活[1-2]方式的不同，清除病毒的方法可分为膜过滤法[3]、色谱法[4-5]、超短时微波加热法、巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂（S/D）法和低pH值孵放法[6]。《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》（下文简称《一般原则》）中要求，验证研究的目的是为了获取充足的试验研究数据以证明生产工艺中是否包含有效的病毒去除/灭活工艺步骤。《一般原则》要求生产工艺中必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤，若不包含，则应根据不同品种的特点增加相应的处理方法，并不得改变制品原有的质量。对于从生物组织中提取制成的生物制品，在工艺上应有2个有效工艺步骤从机制上进行互补，对于非脂包膜病毒，应不少于1个工艺有效步骤有效去除和/或灭活作用;对于通过真核细胞表达的生物制品，要求至少有一个工艺有效步骤，能够有效去除和/或灭活非脂包膜病毒[7]。对于低pH值病毒灭活工艺，非特异模型病毒建议选择有包膜的、对理化条件耐受能力强且耐受范围广的病毒种类，如伪狂犬病病毒;对于纳米膜的过滤工艺，建议选择粒径小的病毒种类，如鼠细小病毒。另外，对病毒去除/灭活的验证要注意工艺过程对样品质量的影响。应考察在工艺处理前后，纯度、蛋白质含量、蛋白质回收率等的差异或变化能否确保产品符合质量标准规定。只有在确保工艺处理前后上述质量指标的差异或变化不明显，才能认为设定的病毒去除/灭活工艺条件是有效的。在工艺验证中，应采用大生产工艺参数中的最差条件在小试生产规模下进行。如在开展低pH值法灭活病毒验证时，采用实际生产pH值、蛋白含量标准规定的最高限与温度范围最低限。在进行膜过滤去除病毒的效果验证时，采用实际生产压力和上样量范围的上限[8]。按照《一般原则》规定，本试验建立了注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体（简称“注射用坏死因子抗体”）膜过滤病毒去除工艺和低pH值孵放病毒灭活工艺，前者选取小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒作为指示病毒，后者选取小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒作为指示病毒，分别进行去除/灭活工艺验证，本试验结果可为该单抗制品的病毒安全性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞

小鼠白血病病毒起始滴度为6.750 lg TCID50/0.1 mL（其中TCID50表示半数组织培养感染剂量），用猫星形胶质细胞进行培养;小鼠微小病毒的起始滴度为6.875 lg TCID50/0.1 mL，用小鼠皮下结缔组织细胞进行培养;呼肠孤病毒的起始滴度为 7.250 lg TCID50/0.1 mL，用幼仓鼠肾细胞进行培养;伪狂犬病毒的起始滴度为 6.875 lg TCID50/0.1 mL，用猪肾细胞进行培养。上述病毒及细胞均由中国食品药品检定研究院保存。

1.2 注射用坏死因子抗体

该注射用坏死因子抗体样品由泰州迈博太科药业有限公司制备，其中纳米膜过滤病毒去除工艺所用注射用坏死因子抗体样品为纯化工艺中通过疏水层析收集的样品，批号分别为008-201702、008-201703、008-201704。pH值法滅活病毒工艺所用样品为亲和层析收集的样品，批号分别为 cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704。

1.3 膜过滤病毒去除工艺的建立及验证

1.3.1 膜过滤病毒去除工艺的建立 预过滤膜（型号为Viresolve Prefilter）和除病毒过滤膜（型号为Viresolve Pro）均购自美国Millipore公司。取纯化工艺中疏水层析收集批号分别为008-201702、008-201703、008-201704的样品，每批分别经过Viresolve Prefilter预过滤和Viresolve Pro除病毒过滤膜（除病毒过滤膜面积为3.1 cm2，过滤压力为220 kPa）过滤，每个病毒、每批样品的体积均在 280 mL 以上。

1.3.2 分子排阻色谱纯度、蛋白质回收率的检测 考察膜过滤去除病毒工艺对过滤前后样品分子排阻色谱纯度、蛋白质总量的影响。取膜过滤前后的样品，用高效液相色谱（HPLC）方法检测分子排阻色谱纯度，根据膜过滤前后的总蛋白质量计算蛋白质的回收率。

1.3.3 膜过滤病毒去除工艺的效果验证

1.3.3.1 病毒的滴定 （1）选用小鼠白血病病毒为指示病毒。将猫星形胶质细胞以6×104个/mL的密度加入96孔细胞培养板中，每孔0.1 mL;在 37 ℃ 培养箱中培养 24 h，设二氧化碳含量为5%，待细胞铺满后，将各对照及处理后的样品进行连续稀释，稀释倍数为10-1～10-11;在细胞培养板的第1列至第11列加入稀释10-1～10-11倍的病毒 0.1 mL/孔;在第12列加入细胞培养基，作为细胞对照;将上述培养板放进温度为37 ℃、含5% CO2的培养箱内，每天观察、记录病变细胞数（孔），直至细胞对照孔内的细胞无法维持正常形态，采用96孔细胞病变法进行病毒滴定，按Karber法计算小鼠白血病病毒滴度。（2）选用小鼠微小病毒作为指示病毒。培养用细胞为小鼠皮下结缔组织细胞，采用与小鼠白血病病毒同样的方法计算小鼠微小病毒滴度。（3）选用呼肠孤病毒作为指示病毒。培养用细胞为幼仓鼠肾细胞，采用与小鼠白血病病毒相同的方法计算呼肠孤病毒滴度。

1.3.3.2 病毒去除效果的验证 取批号为 008-201702、008-201703、008-201704的纯化工艺中疏水层析收集的样品各280 mL以上，分别进行预过滤，取预过滤后的样品按照2%的比例加入指示病毒，混匀，采用设置的膜去除病毒工艺过滤上样液，分别在膜过滤体积为200、240 mL及过滤终点取样，进行残余病毒滴度的检测，检测方法同小鼠白血病病毒。每种指示病毒均用每批上样液测试2次。

1.4 低pH值孵放法病毒灭活工艺的建立及验证

1.4.1 病毒灭活工艺的建立 采用亲和层析收集样品，批号分别为cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704，每批样品分别用25 mmol/L柠檬酸酸盐（pH值为2.8～3.2）或1 mol/L Tris-base调节pH值至3.8，于18 ℃放置4 h后分别于0.5、1.0、2.0、4.0 h取样，用1 mol/L Tris-base调节pH值至中性。

1.4.2 灭活病毒的工艺对分子排阻色谱纯度、蛋白质含量影响的检测 取低pH值孵放前后的样品，用HPLC方法检测分子排阻色谱纯度，再通过紫外分光光度法检测蛋白质含量。

1.4.3 灭活病毒的工艺效果验证

1.4.3.1 病毒的滴定 选用小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒作为指示病毒，小鼠白血病病毒用猫星形胶质细胞培养，伪狂犬病毒用猪肾细胞培养，具体方法同“1.3.3”节，分别滴定并计算小鼠白血病病毒及伪狂犬病毒的滴度。

1.4.3.2 病毒灭活效果的验证 各取5 mL cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704亲和层析收集的样品，用1 mol/L Tris-base调节pH值至中性，制备对照样品。取1.96 mL细胞培养基，加入0.04 mL病毒，使病毒的最终占比为2%，制备病毒对照样品。各取5 mL cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704亲和层析收集的样品，用 1 mol/L Tris-base调节pH值至中性，按照2%的比例分别加入0.102 mL指示病毒（小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒），混匀后除菌过滤，取出2 mL并凍存于-70 ℃环境下，作为零点对照样品;再取出2 mL并于 18 ℃ 放置4 h，冻存于-70 ℃环境下，作为终点对照样品。

各取20 mL cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704亲和层析收集的样品，每批分别用 25 mmol/L 柠檬酸盐（pH值为2.8～3.2）或 1 mol/L Tris-base调节pH值至3.8，按照2%的比例分别加入0.408 mL指示病毒（小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒）混匀，于18 ℃放置4 h，分别于0.5、1.0、2.0、4.0 h取样，用1 mol/L Tris-base调节pH值至中性，除菌过滤后作为处理后样品。样品对照、病毒对照、零点对照、终点对照及处理后样品在处理结束后立即冻存于-70 ℃下，样品滴定时于室温复溶。具体方法同“1.3.3”节，分别滴定并计算小鼠白血病病毒及伪狂犬病毒的滴度，每种指示病毒均用每批的上样液测试2次。

2 结果与分析

2.1 病毒去除工艺的建立及验证

2.1.1 膜过滤对蛋白质回收率及分子排阻色谱纯度的影响 由表1可以看出，膜过滤去除病毒工艺处理的蛋白质回收率均在98%以上，膜过滤前后分子排阻色谱纯度均在98%以上，表明膜过滤后回收率较高，膜过滤对纯度基本无影响，采用膜过滤法去除病毒的工艺是可行的。

由表2可以看出，当滤出液体积达280 mL（008-201702）、282.5 mL（008-201703）、272.5 mL（008-201704）时，样品的小鼠微小病毒下降滴度分别为4.750、4.688、4.750 lg TCID50/0.1 mL，均>4 lg TCID50/0.1 mL。由表3可以看出，当滤出液体积达280 mL（008-201702）、290 mL（008-201703）、271 mL（008-201704）时，样品的呼肠孤病毒下降滴度分别为4.875、4.938、4.813 lg TCID50/0.1 mL，均>4 lg TCID50/0.1 mL。由表4可以看出，当滤出液体积达281.6 mL（008-201702）、272 mL（008-201703）、282.8 mL（008-201704）时，样品的小鼠白血病病毒下降滴度分别为4.375、4.563、4.563 lg TCID50/0.1mL，均>4 lg TCID50/0.1 mL，过滤后的样品符合《一般原则》的要求，表明该工艺可有效去除病毒。

2.2 病毒灭活工艺的建立及验证

2.2.1 低pH值孵放对蛋白质含量及分子排阻色谱纯度的影响 从表5可看出，低pH值孵放在病毒灭活前后对样品蛋白质含量及纯度均无明显影响。

2.2.2 低pH值孵放病毒灭活工艺效果的验证结果 从表6可以看出，指示病毒小鼠白血病病毒经低pH值孵放灭活0.5 h后，cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704的小鼠白血病病毒下降滴度分别达4.438、4.563、4.375 lg TCID50/0.1 mL，均>4 lg TCID50/0.1 mL。由表7可以看出，指示病毒伪狂犬病毒经低pH值孵放灭活0.5 h后，cCC-20170311、cCC-20170321、008-201704的伪狂犬病毒下降滴度分别达4.875、4.938、4.750 lg TCID50/0.1 mL，均≥4 lgTCID50/0.1 mL，随着处理时间的延长，指示病毒小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的下降滴度不再改变，均≥4 lg TCID50/0.1 mL，符合《一般原则》的要求，表明该工艺可有效灭活病毒。

3 讨论与结论

在建立去除病毒的工艺中，应考察预过滤膜（型号为Viresolve Prefilter）和除病毒过滤膜（型号为Viresolve Pro）对上样液中病毒的去除效果、过滤时的压力、恒压载量试验，分析该过滤膜在完全堵塞前所能过滤的最大上样体积。本试验初步设定了如下除病毒的工艺参数：预过滤膜型号为Viresolve Prefilter，除病毒过滤膜型号为Viresolve Pro，压力为220 kPa。试验结果表明，采用膜过滤工艺去除病毒符合工艺需求，该去除病毒工艺的方法可行。膜过滤去除病毒的效果验证试验结果表明，除病毒过滤膜（Viresolve Pro）的孔径为20 nm，选择的指示病毒小鼠微小病毒粒径为20～26 nm，可见小鼠微小病毒对去除病毒效果具有有效的指示作用。用3批注射用坏死因子抗体样品进行病毒去除工艺验证，结果表明，至滤出终点时，小鼠微小病毒的滴度下降值均 >4 lg TCID50/0.1 mL， 符合《一般原则》的要求，证明膜过滤工艺可有效去除小鼠微小病毒，此外，注射用坏死因子抗体最大上样液过滤体积可以达到270 mL，能够满足实际生产需要。

本试验结果还表明，用低pH值（3.8）处理亲和层析收集样品生产工艺对产品的蛋白质含量及分子排阻色谱纯度均不会产生影响。将3批亲和层析收集的样品用于灭活病毒的工艺验证，结果显示，在pH值为3.8、室温为18 ℃的条件下处理0.5 h，指示病毒小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒滴度下降值均>4 lg TCID50/0.1 mL，符合《一般原则》的要求，表明该pH值法在生产过程中可有效灭活病毒。

在单克隆抗体的生产工艺中，可依据蛋白质产物与病毒颗粒大小的不同，利用膜过滤工艺有效去除病毒，在生产中使用一次性除病毒膜包，每次使用后进行完整性测试。该方法已经在国内外多种生物制品的生产中得到了广泛运用[9]。只有病毒的有效直径大于滤膜的孔径，膜过滤法才能有效截留病毒，达到去除病毒的目的，这种方法须要与前文所述方法[1]联合使用才能起到有效去除/灭活病毒的作用。低pH值孵放法是破坏病毒包膜的完整性、阻断病毒与宿主受体结合的途径，使病毒无法感染宿主细胞[10-11]，起到灭活病毒的作用。低pH值孵放法具有方法简单、经济实惠、容易操作等特点，已被用于伪狂犬病毒[10]、猪细小病毒[12]、流感病毒[13]等病毒的灭活。

去除/灭活病毒的理想方法有2个特性：可以部分去除病毒或者破坏病毒的活性和结构，维持生物制品的生物活性、理化性质。病毒去除/灭活工艺的验证研究是为了取得充分的试验数据，确认去除/灭活病毒的工艺步骤是否有效。验证的单克隆抗体应至少包含1个有效的病毒去除/灭活工艺步骤，并能有效去除和/或灭活非脂包膜病毒。对本试验样品进行病毒去除/灭活工艺验证结果表明，经过膜过滤，蛋白质回收率符合规定，分子排阻色谱纯度没有明显变化;用低pH值处理后，蛋白质含量、分子排阻色谱纯度无明显变化。在去除/灭活病毒的验证工艺中，选用的小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒、伪狂犬病毒这4个病毒的理化性质（病毒的大小、核酸类型、有无包膜）有代表性，本试验结果显示，经去除或灭活后，小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒、伪狂犬病毒这4种病毒的滴度下降值均达到了规定的标准（>4 lg TCID50/0.1 mL），证明本试验建立的注射用坏死因子抗体病毒去除/灭活工艺所用方法是有效的。

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